擬穴青蟹精氨酸激酶的過敏性及其構(gòu)效關(guān)系的初步研究.pdf

1、近年來，食用水產(chǎn)品而導(dǎo)致的過敏事件不斷發(fā)生，因此水產(chǎn)品的食用安全性受到了越來越多的重視。以蟹類為代表的甲殼類動物是聯(lián)合國糧農(nóng)組織公布的常見過敏食物之一，其中的原肌球蛋白（Tropomyosin，TM）和精氨酸激酶（Arginine kinase，AK）是存在于甲殼類和軟體動物中的泛過敏原。研究表明，過敏原能夠引發(fā)過敏反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)是抗原表位，對食物過敏原抗原表位的研究可以指導(dǎo)開展低過敏甚至無過敏性食品的加工。迄今為止，已在甲殼類動物和軟

2、體動物的TM中發(fā)現(xiàn)了8個抗原表位，然而對AK抗原表位的研究相對較少。
　　本文以擬穴青蟹為研究對象，通過飽和硫酸銨鹽析和Q-Sepharose柱層析的方法分離純化得到AK。通過雙向電泳（2-D）、過碘酸希夫試劑（PAS）染色證明AK是分子量為40kDa，等電點為6.5的糖蛋白。穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，AK在pH 1.0-11.0范圍內(nèi)均較為穩(wěn)定，但不耐熱，經(jīng)熱處理（>44°C）的AK易形成二聚體和多聚體。模擬胃腸液消化實驗結(jié)果表明，A

3、K不易被胰蛋白酶降解，易被胃蛋白酶降解，經(jīng)胃蛋白酶酶解的AK仍具有IgE結(jié)合能力。抑制性免疫印跡實驗結(jié)果表明，擬穴青蟹AK與其它甲殼類AK具有免疫交叉反應(yīng)。通過分析變性直鏈型和天然構(gòu)象型AK與過敏患者血清的IgE結(jié)合反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，在9份過敏患者血清中有8份能與天然構(gòu)象型AK反應(yīng)，然而能與變性直鏈型AK反應(yīng)的血清只有3份，因此確定擬穴青蟹AK的抗原表位以構(gòu)象型為主。
　　采用RT-PCR和RACE的方法獲得AK的cDNA序列全長1457

4、bp，其中開放閱讀框（Open reading frame，ORF）長1074bp，編碼357個氨基酸，其理論分子量為40.29kDa，等電點為6.44。核苷酸序列和其推導(dǎo)氨基酸序列在Genbank登錄號分別為：JN828652和AFA45340。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，AK在位于215-218殘基處具有一個N-糖基化位點；位于271-278殘基處具有ATP:guanido phosphor-transferase活性位點；Motif預(yù)

5、測表明它們隸屬于磷酸原激酶家族。采用SWISS-MODEL服務(wù)器對擬穴青蟹AK進(jìn)行自動建模，得到其三維結(jié)構(gòu)。分別使用DNA STAR Protean和Disco Tope 2.0軟件預(yù)測出了擬穴青蟹AK的9個線性和7個構(gòu)象型B細(xì)胞抗原表位。
　　對擬穴青蟹AK進(jìn)行表達(dá)和分段表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物rAK、rAK1、rAK2與甲殼類過敏患者血清具有較強(qiáng)的IgE結(jié)合能力，而rAK3的IgE結(jié)合能力很弱，說明rAK1和rAK2所在區(qū)域為抗原表位

6、優(yōu)勢區(qū)。此外，通過重疊肽庫的方法發(fā)現(xiàn)了擬穴青蟹AK的3個線性抗原表位（Epitope 1：127-141,Epitope 2：141-155和Epitope 3：211-225），并模擬出這3個線性表位在三級結(jié)構(gòu)中的位置，值得一提的是這三個抗原表位就位于rAK1和rAK2所在區(qū)域。
　　本研究對蟹類AK的過敏性和構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了分析，初步確定了其抗原表位的類型和抗原表位優(yōu)勢區(qū)。這些結(jié)果可望為全面了解蟹類過敏原，指導(dǎo)低過敏性食品的開發(fā)