對(duì)蝦精氨酸激酶與WSSV作用性質(zhì)初步研究.pdf

1、對(duì)蝦白斑綜合征病毒(whitespotsyndromevirus，WSSV)自1992年以來仍是世界范圍內(nèi)對(duì)蝦爆發(fā)性死亡的主要病原，對(duì)我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失。目前在WSSV診斷檢測(cè)技術(shù)、病毒粒子的蛋白組成及其分子架構(gòu)、功能基因、對(duì)蝦免疫基因?qū)SSV感染的應(yīng)答等方面取得了一定進(jìn)展。現(xiàn)已鑒定得到一些WSSV蛋白與宿主細(xì)胞成分存在相互作用，可以明顯的延遲或中和WSSV的感染，另有一些對(duì)蝦蛋白，如PmRab7(Penaeusmonod

2、onRab7)、β-integrin（整合素）和F1-ATP合酶β亞基也參與了WSSV感染。為解析WSSV感染的分子機(jī)制，并探索通過阻斷其感染通路而達(dá)到生物防治的途徑，本研究主要集中在與WSSV相互作用的宿主成分，即受體蛋白。本實(shí)驗(yàn)室前期通過對(duì)WSSV囊膜蛋白VP31和VP37的宿主受體蛋白的探究，洗脫下了對(duì)蝦鰓膜蛋白中的精氨酸激酶(AK)，證實(shí)精氨酸激酶與WSSV存在結(jié)合關(guān)系，可能是WSSV在宿主體內(nèi)的一個(gè)作用蛋白。從精氨酸激酶的重要

3、生理功能來說，它很可能在WSSV侵染宿主的過程扮演重要角色。國(guó)內(nèi)外對(duì)精氨酸激酶的研究目前多集中于進(jìn)化、能量供給方面，將其作為病毒潛在受體進(jìn)行研究還是首次。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上對(duì)精氨酸激酶做了如下研究:
　　 1.精氨酸激酶原核表達(dá)及抗體制備:根據(jù)已構(gòu)建的pET30a-AK和pET30a-VP31表達(dá)載體，通過原核表達(dá)技術(shù)對(duì)精氨酸激酶進(jìn)行了表達(dá)，并制備了大量純化的蛋白。
　　 2.精氨酸激酶組織嗜性分析:為了更好的了解精氨酸激

4、酶與WSSV的作用，提取凡納濱對(duì)蝦的鰓、肌肉、淋巴器官、血細(xì)胞的RNA，以β-actin為內(nèi)參，對(duì)精氨酸激酶在各組織中的轉(zhuǎn)錄量進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明精氨酸激酶在凡納濱對(duì)蝦肌肉中的表達(dá)量十分豐富，而在血細(xì)胞中沒有檢測(cè)到精氨酸激酶。取中國(guó)對(duì)蝦各組織（血細(xì)胞、淋巴器官、胃、肝胰腺、鰓、肌肉、腸、上皮、眼、心臟）中精氨酸激酶的檢測(cè)。結(jié)果顯示在對(duì)蝦這10種組織種均有精氨酸激酶的表達(dá)。
　　 3.精氨酸激酶對(duì)WSSV感染的應(yīng)答效應(yīng):選健康的

5、凡納濱對(duì)蝦，采取肌肉注射的方式，進(jìn)行WSSV人工感染，在感染后0，4，8，12，24，36，48，72h分別取鰓組織和肌肉組織，對(duì)精氨酸激酶的轉(zhuǎn)錄量進(jìn)行了半定量監(jiān)測(cè)。結(jié)果表明WSSV的侵染對(duì)AK基因的表達(dá)量有影響，其表達(dá)量在4-8h內(nèi)呈上升趨勢(shì)，8h轉(zhuǎn)錄量突然升高，24h達(dá)到最值，36h表達(dá)量驟降，72h表達(dá)量再次升高。具體原因與功能聯(lián)系有待進(jìn)一步的分析驗(yàn)證。
　　 4.精氨酸激酶對(duì)WSSV囊膜蛋白VP31的體外磷酸化作用分析:

6、針對(duì)精氨酸激酶的特殊功能，以及能與VP31相互作用的關(guān)系，猜想精氨酸激酶可能對(duì)VP31具有磷酸化的作用，進(jìn)而在WSSV入侵細(xì)胞時(shí)起到了提供能量的作用。通過體外磷酸化實(shí)驗(yàn)并結(jié)合雙向電泳技術(shù)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照?qǐng)D片相比，磷酸化處理過的rVP31有一個(gè)蛋白點(diǎn)明顯加強(qiáng)并且向等電點(diǎn)降低方向移動(dòng)，顯示精氨酸激酶對(duì)VP31具有磷酸化作用。
　　 5.精氨酸激酶、VP31與WSSV的相互作用關(guān)系:采用細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)rVP31、WSSV