三種楊樹再生體系的建立及青海青楊遺傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、楊樹在全球分布十分廣泛，是重要的工業(yè)用材林和生態(tài)防護(hù)林樹種。由于楊樹和其它林木一樣，存在育種周期長、具有高度的雜合性和復(fù)雜的遺傳特性等特點，使得傳統(tǒng)的楊樹育種方法已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代育種的要求，所以，利用組織培養(yǎng)技術(shù)和基因工程方法來滿足實踐中對楊樹育種的要求具有重要的意義。目前，在楊樹的眾多樹種中，只有白楊派樹種在組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化方面相對成熟。為此，本試驗通過組織培養(yǎng)技術(shù)，建立了青楊派樹種青海青楊、黑楊派樹種三倍體山哈楊和廊坊楊3號的離

2、體再生體系，并結(jié)合農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，以青海青楊為受體材料，轉(zhuǎn)化YUCCA1基因，建立其遺傳轉(zhuǎn)化體系。試驗結(jié)果如下：
　　 本試驗建立了三種楊樹的離體再生體系，分別為：①以青海青楊莖段為外植體，通過篩選其各個生長階段最佳培養(yǎng)基，建立了其穩(wěn)定高效的再生體系，結(jié)果表明：不定芽誘導(dǎo)分化最佳培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.05mg·L-1+蔗糖25g·L-1+瓊脂7g·L-1，在(25+1)℃，光強(qiáng)1500-2000

3、 lx，光周期12-14 h/d的條件下，分化率為82.0％；不定芽伸長最佳培養(yǎng)基為MS+NAA0.005mg·L-1+蔗糖25g·L-1+瓊脂7g·L-1，并具有較好的壯苗作用；繼代增殖最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA0.1mg·L-1+NAA0.3mg·L-1+蔗糖25g·L-1+瓊脂7g·L-1，30d增殖系數(shù)達(dá)5.1；生根最佳培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.3mg·L-1+蔗糖25g·L-1+瓊脂7g·L-1，生根率可達(dá)100％；②以三

4、倍體山哈楊莖段為外植體，設(shè)計了4種不同激素配比組合篩選其不定芽誘導(dǎo)分化最佳培養(yǎng)基，結(jié)果表明，6-BA與TDZ混合使用誘導(dǎo)效果最好，在培養(yǎng)基1/2MS+6-BA0.6mg·L-1+TDZ0.01mg·L-1+NAA0.02 mg·L-1+蔗糖25g·L-1+瓊脂7g·L-1上，不定芽生長健壯，分化率為82.2％；在此培養(yǎng)基上可進(jìn)行試管苗的繼代增殖，待不定芽大量分化后轉(zhuǎn)入MS+NAA0.005mg·L-1+蔗糖25g·L-1+瓊脂7g·L-

5、1中，有很好的伸長效果，最后接種于1/2MS+IBA0.2mg·L-1+蔗糖25g·L-1+瓊脂7g·L-1瓊脂中誘導(dǎo)生根，即可培育成完整植株；③以廊坊楊3號莖段為外植體，通過參考上述青海青楊和三倍體山哈楊的組培再生體系建立情況，設(shè)計了幾種不同培養(yǎng)基來誘導(dǎo)不定芽分化、增殖及生根，結(jié)果表明，在1/2MS+6-BA1.0mg·L-1+TDZ0.1 mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+蔗糖25g·L-1+瓊脂7g·L-1中，分化效果較好，

6、分化率達(dá)80.0％；在MS+6-BA0.1mg·L-1+TDZ0.1mg·L-1+NAA0.3mg·L-1+蔗糖25g·L-1+瓊脂7g·L-1上，通過誘導(dǎo)愈傷組織來分化大量不定芽進(jìn)行增殖，增殖系數(shù)達(dá)8.2；在1/2MS+NAA0.05 mg·L-1+IBA0.1mg·L-1+瓊脂7g·L-1上，誘導(dǎo)根系健壯，有利于移栽成活。
　　 本試驗以青海青楊莖段外植體再生體系的建立為基礎(chǔ)，研究了其葉片外植體不定芽誘導(dǎo)分化的最佳培養(yǎng)基，篩

7、選得到在1/2MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.05mg·L-1+IBA0.05mg·L-1+蔗糖25g·L-1+瓊脂7g·L-1上葉片分化較好，分化率可達(dá)90.0％，符合進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的要求；研究了青海青楊不同培養(yǎng)階段對篩選劑抗生素的敏感性，為轉(zhuǎn)化苗在選擇壓下有效篩選打下基礎(chǔ)，青海青楊葉片分化不定芽的卡那霉素(Kan)的臨界濃度為20mg·L-1，試管苗生根的臨界濃度為15mg·L-1；研究了羧芐青霉素(Car)在農(nóng)桿菌侵染后

8、的抑菌效果，探討了抗生素適宜的使用方法，即：在葉片侵染農(nóng)桿菌4d內(nèi)向培養(yǎng)基中加入400mg·L-1羧芐青霉素，可以有效地抑制農(nóng)桿菌的過度繁殖，對外植體正常生長影響較小。通過上述幾方面，建立了青海青楊遺傳轉(zhuǎn)化穩(wěn)定的受體系統(tǒng)，為進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化打下基礎(chǔ)。并進(jìn)一步研究了影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的YUCCA1基因?qū)肭嗪Ｇ鄺畹牡囊蜃?，建立了青海青楊簡單、有效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，即預(yù)培養(yǎng)1d，在OD600=0.4的菌液侵染時間10min，共培養(yǎng)3d，共培養(yǎng)基中不加

9、乙酰丁香酮(AS)，共培養(yǎng)后延遲14d選擇，遺傳轉(zhuǎn)化效率最高，為22.0％。最后本試驗通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法共獲得159個Kanr芽，通過層層篩選，得到了49株Kanr植株，最后通過PCR分子檢測，得到8株P(guān)CR陽性植株。
　　 綜上所述，通過組織培養(yǎng)技術(shù)，研究了青海青楊、三倍體山哈楊、廊坊楊3號不同階段生長的最佳培養(yǎng)基，建立了其穩(wěn)定高效的再生體系，為進(jìn)一步規(guī)?；a(chǎn)和基因工程育種提供了試驗基礎(chǔ)；以青海青楊為受體材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法