大巖桐再生體系的建立及遺傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、大巖桐（Sinningia speciosa）原產(chǎn)巴西，是苦苣苔科巖桐屬多年生球根草本花卉，是一種春夏季節(jié)室內(nèi)盆花，世界各地廣泛栽培。大巖桐喜溫暖，不耐低溫，5℃以下難以越冬，培育抗寒品種有望實(shí)現(xiàn)非溫室越冬，擴(kuò)大種植面積，降低生產(chǎn)成本。大巖桐播種后160-210d開花，營養(yǎng)生長期較長，培育早花品種，可提早上市，提高商業(yè)價值。
　　 本課題將AtCBF1抗寒調(diào)控基因和AtLEAFY早花基因通過根癌農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)化大

2、巖桐，主要結(jié)果如下:
　　 (1)建立了大巖桐的再生體系。先將盆栽的生長旺盛的大巖桐幼嫩葉片用酒精、升汞消毒，放入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽。然后，用切掉莖尖的不定芽進(jìn)行繼代增殖。最后，切下小芽進(jìn)行生根，形成再生植株并移栽成活。獲得各培養(yǎng)階段適宜的培養(yǎng)基配方:芽誘導(dǎo)和繼代增殖培養(yǎng)基，MS+0.5mg·L-16-BA+0.1mg·L-1 NAA;生根培養(yǎng)基，1/2MS+0.2mg·L-1 NAA。
　　 (2)

3、構(gòu)建擬南芥中抗寒基因AtCBF1和早花基因AtLEAFY的植物表達(dá)載體。以擬南芥葉片cDNA為模板，擴(kuò)增得到CBF1基因，利用BamHⅠ和SacⅠ酶切位點(diǎn)，將AtCBF1與質(zhì)粒pBI121連接，構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-AtCBF1;以擬南芥花蕾cDNA為模板，擴(kuò)增得到LEAFY基因，利用XmaⅠ和SacⅠ酶切位點(diǎn)，將AtLEAFY與質(zhì)粒pBI121連接，構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-AtLEAFY,將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌

4、LBA4404。
　　 (3)以紅、紫色花重瓣大巖桐葉片、葉柄為材料，進(jìn)行愈傷組織及不定芽的誘導(dǎo)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+1.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1 NAA和MS+2.0mg·L-16-BA+0.2mg·L-1 NAA均能誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織和不定芽，但是芽的分化前者比后者要快。以大巖桐無菌苗葉片為材料，進(jìn)行再生芽的卡那霉素(Kan)濃度梯度實(shí)驗(yàn)，確定了20mg·L-1 Kan為葉片誘導(dǎo)出芽篩選壓。以大巖桐無菌苗不定芽為