柑橘宿主對(duì)黃龍病病原菌侵染的應(yīng)答機(jī)制.pdf

1、柑橘黃龍病或青果病是一種極具破壞性的柑橘病害,嚴(yán)重威脅著全球的柑橘產(chǎn)業(yè)。該病害被認(rèn)為是由一種專(zhuān)生于植物韌皮部組織的細(xì)菌引起。目前在柑橘中已發(fā)現(xiàn)了其三種菌株類(lèi)型,即亞洲韌皮部桿菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)、非洲韌皮部桿菌(Candidatus Liberibacter africanus)和美洲韌皮部桿菌(CandidatusLiberibacter americanus)。其傳播途徑包括嫁接和

2、柑橘木虱傳播(包括亞洲柑橘木虱Diaphorina citri和非洲木虱Trioza erytreae)。
　　 由于引起黃龍病的三種韌皮部桿菌至今還未能獲得純化培養(yǎng),因此其科赫氏假說(shuō)(Koch’s postulates)還未得到驗(yàn)證,相關(guān)方面的研究(如致病機(jī)理)也受到很大約束。另一方面,所有已知的柑橘品種及柑橘近緣種都會(huì)感染黃龍病,感病后的植株不僅不能治愈,且易感程度高的品種如甜橙、葡萄柚等會(huì)在幾年內(nèi)逐漸衰亡。但某些品種具有一

3、定的耐病性,如檸檬和其他少數(shù)近緣品種。然而,具有抗性的品種至今還未發(fā)現(xiàn)。因此,針對(duì)黃龍病的管理策略主要局限于利用殺蟲(chóng)劑控制木虱、挖除感病植株和培育無(wú)菌苗,尚缺乏有效的調(diào)控措施。
　　 病原菌侵染植物后,可能引起宿主在基因轉(zhuǎn)錄水平、蛋白質(zhì)水平、代謝水平以及顯微結(jié)構(gòu)上發(fā)生一系列變化。研究柑橘宿主在這些水平上對(duì)黃龍病病原菌的應(yīng)答,將有助于闡明黃龍病的發(fā)病機(jī)理,從而為提出新型有效的控制措施提供重要依據(jù)。因此,本論文通過(guò)生理生化、蛋白組學(xué)

4、、基因芯片和顯微鏡等技術(shù)研究了柑橘宿主對(duì)黃龍病細(xì)菌的應(yīng)答機(jī)制,并且全面比較了耐病品種粗檸檬和易感品種甜橙感染黃龍病后在基因表達(dá)水平、顯微結(jié)構(gòu)方面的變化。主要結(jié)果與結(jié)論如下:
　　 ①黃龍病感染甜橙后,淀粉在無(wú)癥狀和有癥狀的成熟葉中大量積累,與淀粉分解代謝相關(guān)的基因DPE2和MEX1被下調(diào)表達(dá)。在無(wú)癥狀的葉中,葉片和葉中脈的蔗糖和果糖都有顯著增加,葡萄糖在葉中脈中水平升高,而麥芽糖含量在葉片和葉中脈中明顯降低；在有癥狀的葉中,蔗糖

5、和葡萄糖水平顯著升高,麥芽糖含量降低,果糖含量沒(méi)有顯著變化。這些結(jié)果說(shuō)明,甜橙感染黃龍病后其糖代謝失去平衡,淀粉分解代謝可能受到抑制。此外,細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性在感病植株的葉中顯著升高。結(jié)合以上結(jié)果,我們推測(cè)Ca.L.asiaticus的營(yíng)養(yǎng)方式屬于活體營(yíng)養(yǎng)型。
　　 ②利用同位素標(biāo)記的相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)(isobaric tags for relative andabsolute quantification,iTRAQ),成

6、功鑒定了甜橙感染黃龍病后差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示,感病有癥狀和無(wú)癥狀葉中分別有20和10個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。
　　 ③幾丁質(zhì)酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶、脂氧合酶和4個(gè)miraculin類(lèi)似蛋白在感病無(wú)/有癥狀甜橙葉片樣品中被顯著誘導(dǎo)了3.6-13.7倍,這些蛋白主要涉及到脅迫、防御過(guò)程,說(shuō)明感病后甜橙的脅迫應(yīng)答或防御反應(yīng)被激活。并且,這些被顯著誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)有可能被開(kāi)發(fā)成為黃龍病的診斷標(biāo)記。
　　 ④基因芯片結(jié)果表明,

7、接種黃龍病細(xì)菌后5、17和27周,粗檸檬中差異表達(dá)基因的數(shù)量分別為684、411和1053；甜橙中分別為391、433和366。受黃龍病顯著影響的代謝途徑有:光合作用、細(xì)胞壁、轉(zhuǎn)錄因子、激素代謝、脅迫應(yīng)答和糖代謝等。
　　 ⑤光合作用相關(guān)基因和MYB-相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在接種后的粗檸檬和甜橙中都被下調(diào)表達(dá)。但是,許多代謝途徑在兩者中受到差異調(diào)控。如乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在接種后的甜橙中受到顯著調(diào)控,而生長(zhǎng)素、蕓苔類(lèi)固醇和水楊酸代謝相關(guān)基因在接種

8、后的粗檸檬中表達(dá)水平發(fā)生顯著變化；細(xì)胞壁相關(guān)代謝在粗檸檬中的改變比甜橙更明顯。與韌皮部堵塞物質(zhì)相關(guān)的pp2基因只在感病甜橙中被誘導(dǎo)表達(dá),而在粗檸檬中沒(méi)有顯著變化。這些差異應(yīng)答有助于闡明粗檸檬對(duì)黃龍病的耐病性或甜橙的易感性,并為通過(guò)基因工程技術(shù)提高柑橘對(duì)黃龍病的耐受能力提供候選基因。
　　 ⑥通過(guò)光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡技術(shù)比較研究了粗檸檬和甜橙感染黃龍病后不同器官的顯微結(jié)構(gòu)變化,結(jié)果顯示,感病后粗檸檬和甜橙有癥狀葉的顯微結(jié)構(gòu)發(fā)

9、生了顯著改變,如葉中脈韌皮部細(xì)胞塌陷、篩管堵塞和淀粉大量累積等。然而,粗檸檬無(wú)癥狀葉受影響程度明顯小于甜橙無(wú)癥狀葉；粗檸檬根的顯微結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯變化,而甜橙根在發(fā)病過(guò)程中韌皮部纖維被降解、存貯型淀粉被逐漸消耗。這些顯微結(jié)構(gòu)上的差異變化在一定程度上解釋了粗檸檬對(duì)黃龍病的耐病性和甜橙的易感性。
　　 ⑦以羧基熒光素(carboxyfluorescein)為標(biāo)記的韌皮部運(yùn)載實(shí)驗(yàn)表明,感病的粗檸檬其成熟葉片仍能行使接近正常的運(yùn)輸功能,而感