睪丸注射LV載體及安全性評定.pdf

1、慢病毒(Lentivirus)是一類逆轉錄病毒，含有依賴于RNA的多聚酶即逆轉錄酶，可侵入宿主細胞內，在自身逆轉錄酶的作用下，以病毒RNA為模板合成cDNA，以此cDNA為模板合成雙鏈DNA，通過病毒整合酶作用整合到宿主細胞的基因組中。以慢病毒為基礎構建而成的慢病毒載體(Lentiviral vector)具有轉移效率高、免疫反應小、作用范圍廣等優(yōu)點。
　　 睪丸注射法即將病毒包裝的外源DNA直接注射到雄性動物睪丸內，感染精原細

2、胞或精原干細胞后將外源基因轉染到精子，然后利用體外授精、人工授精等技術生產轉基因動物的技術。該方法操作簡便，但是否安全、有效，尚待驗證。
　　 本試驗通過分析經睪丸注射后的牛血液和精液指標，并用PCR方法檢測外源DNA在睪丸內與精子整合后是否擴散到全身組織中；應用電子顯微鏡鏡技術研究睪丸注射LV載體對牛睪丸組織的影響，旨在探討睪丸注射法的安全性和效果，為進一步開發(fā)轉基因技術奠定基礎。
　　 本課題研究內容主要包括以下兩個

3、部分：
　　 1.睪丸注射慢病毒對精液品質的影響
　　 本試驗采用多點睪丸注射，注射后對實驗牛多次采精，對精液進行精液常規(guī)品質檢測，主要指標為密度、活力和外觀色澤。將精液制成涂片，置于400倍電子顯微鏡下觀察精子形態(tài)及密度。
　　 實驗結果表明：實驗組牛精液密度、活力略低于對照組牛精液，但是相差不大。在400倍電子顯微鏡下觀察，實驗組精子密度低于對照組，精子形態(tài)正常，畸形精子率低。
　　 2.血液、精液外

4、源DNA檢測
　　 本試驗通過對血液常規(guī)指標分析及外源基因的PCR擴增，來確定慢病毒載體在宿主體內是否發(fā)生基因轉移擴散到其他組織中。本實驗室PCR方法靈敏度可達到10個拷貝數，對外源BSD基因進行擴增，對擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。
　　 實驗結果表明：在血液DNA及精液DNA中均未檢測到外源BSD序列。
　　 3.睪丸注射慢病毒對血液生理生化指標影響
　　 血常規(guī)檢測各項指標利用Microsoft