SPIO及LV-GFP對(duì)TSCs標(biāo)記的有效性和安全性分析.pdf

1、研究背景:
　　肌腱干細(xì)胞(TSCs)是來源于肌腱組織的一種具有高度增殖潛能、正常情況下分化為肌腱細(xì)胞的一種前體細(xì)胞,2007年Bi等首次從兔肌腱內(nèi)分離,并證實(shí)TSCs具有成骨、成脂、成軟骨等多向分化潛能,大量研究表明外源性TSCs有可能成為肌腱損傷和肌腱病細(xì)胞治療的重要手段。TSCs在體外的生物學(xué)行為變化及在體內(nèi)的定植和遷移變化是TSCs相關(guān)研究的核心問題之一;有效、安全的標(biāo)記方法對(duì)所移植的TSCs進(jìn)行示蹤對(duì)其相關(guān)基礎(chǔ)和臨床研究

2、至關(guān)重要。
　　國外有關(guān)TSCs的研究均集中于其分子生物學(xué)特性的相關(guān)研究,而對(duì)于其體內(nèi)移植的示蹤及觀察等臨床應(yīng)用研究尚無相關(guān)報(bào)道。目前干細(xì)胞標(biāo)記方法較多,均存在各自的優(yōu)缺點(diǎn)。通過查閱大量文獻(xiàn),我們發(fā)現(xiàn),SPIO、LV-GFP標(biāo)記技術(shù)可能適合于TSCs的體內(nèi)外標(biāo)記示蹤。結(jié)合SPIO可活體、無創(chuàng)示蹤,適用于臨床推廣的優(yōu)點(diǎn),以及慢病毒(LV,Lentivirus)介導(dǎo)的GFP轉(zhuǎn)染示蹤操作簡便、成本低廉、熒光表達(dá)穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn),本課題擬對(duì)SP

3、IO、LV-GFP標(biāo)記TSCs方法的有效性、安全性進(jìn)行探討。
　　目的:
　　1.在文獻(xiàn)報(bào)道基礎(chǔ)上,改進(jìn)TSCs酶消化法,建立穩(wěn)定高效的TSCs分離、獲取方法;
　　2.探索SPIO及LV-GFP兩種細(xì)胞示蹤標(biāo)記方法合適的標(biāo)記條件,分析它們對(duì)TSCs標(biāo)記的有效性和安全性,及其對(duì)TSCs生物學(xué)特性的影響;
　　3.觀察上述方法在體內(nèi)標(biāo)記、示蹤的有效性;
　　通過本課題研究,擬為TSCs的體內(nèi)外示蹤提供有效和安

4、全的技術(shù)方法和理論支持。
　　方法:
　　1.在國外文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上,將傳統(tǒng)酶消化-過濾法予以改進(jìn),不過濾而直接種植來分離、培養(yǎng)大鼠TSCs,并利用流式分析、免疫熒光、多向誘導(dǎo)分化等手段對(duì)該法獲取的TSCs進(jìn)行鑒定。
　　2.采用葡聚糖包裹的SPIO和慢病毒介導(dǎo)的綠色熒光蛋白兩種標(biāo)記手段對(duì)TSCs進(jìn)行標(biāo)記,觀察SPIO濃度對(duì)TSCs標(biāo)記有效率、體外標(biāo)記后MRI檢測(cè)效率及其對(duì)TSCs的生長曲線的影響;
　　3.摸索

5、不同MOI值Lv-GFP對(duì)TSCs標(biāo)記的有效率、體外標(biāo)記傳代衰減情況、檢測(cè)其對(duì)TSCs干性的影響,選擇合最佳的MOI值。
　　4.建立大鼠跟腱急性斷裂模型,將示蹤標(biāo)記的TSCs在損傷部位注射,于損傷早期(1周)及瘢痕重建后(6周)取材,觀察經(jīng)標(biāo)記的TSCs在急性跟腱斷裂模型中的遷移、定植情況,證實(shí)該示蹤方法的有效性。
　　結(jié)果:
　　1.通過我們改進(jìn)的TSCs酶消化法,一只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物即可獲取4瓶原代細(xì)胞,較傳統(tǒng)酶消化-過

6、濾法,該法可多量、更穩(wěn)定的獲取原代細(xì)胞;該法提取的TSCs形態(tài)、克隆形成能力及增殖能力符合干細(xì)胞特征;Ⅰ型膠原、胚胎表面抗原SSEA4、Oct4表達(dá)陽性,Ⅲ型膠原表達(dá)陰性;干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD90、CD44呈陽性表達(dá);CD34、CD106呈陰性表達(dá);在體外誘導(dǎo)的情況下TSCs具有明確的成脂、成骨和成軟骨分化能力。
　　2.葡聚糖包裹的SPIO能夠標(biāo)記TSCs,標(biāo)記有效率隨SPIO濃度增大而增加,作用濃度達(dá)到8ug/ml時(shí)標(biāo)記效率>

7、95％,細(xì)胞內(nèi)能夠有效觀察到鐵顆粒吞噬,但其對(duì)TSCs的增殖影響很大。
　　3.LV-GFP在體外能夠有效標(biāo)記TSCs,標(biāo)記有效率隨感染復(fù)數(shù)(MOI值)增加而增加,最佳MOI值為500,熒光強(qiáng)度值不隨體外傳代而減低,對(duì)成脂、成骨、成軟骨相關(guān)基因無明顯影響。
　　4.外源性TSCs經(jīng)過LV-GFP標(biāo)記后,能夠在異體正常肌腱內(nèi)隨肌腱纖維的走行定植,在急性跟腱斷裂模型中定植于斷裂部位及形成的瘢痕中,超過6周仍能有效觀察。
　

8、　結(jié)論:
　　1.經(jīng)過我們改進(jìn)的酶消化法分離、培養(yǎng)大鼠跟腱來源TSCs可靠、有效,能夠更多且穩(wěn)定的獲取TSCs;經(jīng)鑒定,該方法提取的TSCs具有明確的干細(xì)胞特性,有多向分化潛能。
　　2.葡聚糖包裹的SPIO雖然能夠可靠標(biāo)記大鼠TSCs,但對(duì)其增殖能力影響過大,可能不適用于TSCs的標(biāo)記示蹤,其他劑型的SPIO對(duì)TSCs標(biāo)記特性仍有待進(jìn)一步研究。
　　3.慢病毒介導(dǎo)的GFP在體外對(duì)TSCs示蹤標(biāo)記有效可靠,標(biāo)記有效率不