辣椒疫霉elicitins基因在煙草中超表達對煙草抗病的影響分析.pdf

1、疫病是辣椒重要病害之一,當前還沒有有效的防治手段,培育和推廣應用抗病品種是解決辣椒病害的最為根本有效的技術對策,而現代基因工程為培育抗病品種提供了有力的手段并已經顯示出廣闊的應用前景,開發(fā)在抗病基因工程中有應用價值的基因并闡明其作用機制是當前十分重要的研究課題。elicitins是存在于Phytophthora和Pythium兩個屬的植物病原卵菌的能激活植物防御反應的激發(fā)子,在茄科植物抗病基因工程中具有十分重要的潛在利用價值,而且,El

2、icitins與茄科植物的互作系統(tǒng)為研究植物抗病防衛(wèi)信號傳導途徑提供了一個極好的模式。本研究以2個辣椒疫霉elicitins基因全長cDNA為模板構建超表達載體,并利用農桿菌介導的煙草葉片遺傳轉化系統(tǒng),將elicitins基因轉入到煙草中,然后對T1代轉基因植株進行進一步的功能分析,旨在為進一步研究elicitin在茄科植物抗病基因工程中的利用價值及其可能的作用機制奠定基礎。主要研究如下:
　　 1)利用Gateway技術構建含

3、有elicitins基因的超表達載體。以兩個elicitins基因全長cDNA為模板,以特異性引物通過兩步PCR擴增獲得帶有attB接頭的目的片段,然后與目的載體pDONRTM207進行BP反應獲得入門克隆載體,再通過LR反應克隆至超表達載體pk7wg2上獲得目的表達載體。將構建好的目的表達載體通過農桿菌EHA105躪株介導轉入到煙草中,一共轉了60個外植體,分別獲得45和68個再生植株,其中分別有40和65個為陽性克隆。待開花結果后,

4、收取種子保存?zhèn)溆谩?br>　　 2)將收獲的轉基因種子與對照煙草種子K326一起培育進行T1代的抗病分析。每個基因選取兩個株系進行實驗,在煙草長到4—5片葉期分別人工接種辣椒青枯菌和煙草赤星病菌,然后觀察轉基因型和野生型的表型變化情況。結果表明,elicitn7和elictin24在煙草中超表達對人工接種的辣椒青枯菌均有抗性,且相對對照抗性明顯；elictin7在煙草中超表達對人工接種的煙草赤星病菌的抗性比elictin24的抗性弱,

5、但相對野生型抗病,且篩選出了高抗株系elictin24—3。
　　 3)構建2個elictins基因的原核表達載體,并用誘導劑誘導其融合在蛋白的表達。將獲得的融合蛋白分別人工注射辣椒疫霉宿主煙草K326和辣椒P120的功能葉片,同時以BSA蛋白為空白對照進一步研究elictin蛋白對雙子葉植物的影響。結果表明,融合蛋白注射后,均能誘導煙草和辣椒產生HR活性。這說明原核表達并沒有使pET32a:elictins融合蛋白失去生物活性