辣椒疫霉elicitins基因在煙草中超表達(dá)對煙草抗病的影響分析.pdf

1、疫病是辣椒重要病害之一,當(dāng)前還沒有有效的防治手段,培育和推廣應(yīng)用抗病品種是解決辣椒病害的最為根本有效的技術(shù)對策,而現(xiàn)代基因工程為培育抗病品種提供了有力的手段并已經(jīng)顯示出廣闊的應(yīng)用前景,開發(fā)在抗病基因工程中有應(yīng)用價值的基因并闡明其作用機(jī)制是當(dāng)前十分重要的研究課題。elicitins是存在于Phytophthora和Pythium兩個屬的植物病原卵菌的能激活植物防御反應(yīng)的激發(fā)子,在茄科植物抗病基因工程中具有十分重要的潛在利用價值,而且,El

2、icitins與茄科植物的互作系統(tǒng)為研究植物抗病防衛(wèi)信號傳導(dǎo)途徑提供了一個極好的模式。本研究以2個辣椒疫霉elicitins基因全長cDNA為模板構(gòu)建超表達(dá)載體,并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉片遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng),將elicitins基因轉(zhuǎn)入到煙草中,然后對T1代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行進(jìn)一步的功能分析,旨在為進(jìn)一步研究elicitin在茄科植物抗病基因工程中的利用價值及其可能的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。主要研究如下:
　　 1)利用Gateway技術(shù)構(gòu)建含

3、有elicitins基因的超表達(dá)載體。以兩個elicitins基因全長cDNA為模板,以特異性引物通過兩步PCR擴(kuò)增獲得帶有attB接頭的目的片段,然后與目的載體pDONRTM207進(jìn)行BP反應(yīng)獲得入門克隆載體,再通過LR反應(yīng)克隆至超表達(dá)載體pk7wg2上獲得目的表達(dá)載體。將構(gòu)建好的目的表達(dá)載體通過農(nóng)桿菌EHA105躪株介導(dǎo)轉(zhuǎn)入到煙草中,一共轉(zhuǎn)了60個外植體,分別獲得45和68個再生植株,其中分別有40和65個為陽性克隆。待開花結(jié)果后,

4、收取種子保存?zhèn)溆谩?br>　　 2)將收獲的轉(zhuǎn)基因種子與對照煙草種子K326一起培育進(jìn)行T1代的抗病分析。每個基因選取兩個株系進(jìn)行實驗,在煙草長到4—5片葉期分別人工接種辣椒青枯菌和煙草赤星病菌,然后觀察轉(zhuǎn)基因型和野生型的表型變化情況。結(jié)果表明,elicitn7和elictin24在煙草中超表達(dá)對人工接種的辣椒青枯菌均有抗性,且相對對照抗性明顯；elictin7在煙草中超表達(dá)對人工接種的煙草赤星病菌的抗性比elictin24的抗性弱,

5、但相對野生型抗病,且篩選出了高抗株系elictin24—3。
　　 3)構(gòu)建2個elictins基因的原核表達(dá)載體,并用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)其融合在蛋白的表達(dá)。將獲得的融合蛋白分別人工注射辣椒疫霉宿主煙草K326和辣椒P120的功能葉片,同時以BSA蛋白為空白對照進(jìn)一步研究elictin蛋白對雙子葉植物的影響。結(jié)果表明,融合蛋白注射后,均能誘導(dǎo)煙草和辣椒產(chǎn)生HR活性。這說明原核表達(dá)并沒有使pET32a:elictins融合蛋白失去生物活性