外源PHSP1基因在大腸桿菌和煙草中的表達及分析.pdf

1、PHSP1，豌豆(Pisum sativum)線粒體熱激蛋白70(mitoehondrial heatshock protein，mtHSP70)基因，其編碼產(chǎn)物為HSP70家族成員，在線粒體前體蛋白跨膜轉運中起著重要作用。 本研究首先利用基因工程方法構建了原核表載體pET-28a-PHSP1和pET-His-PHSP1將重組質(zhì)粒pET-28a-PHSP1轉化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)0.5mmol/L IPTG(異丙基B-

2、D-硫代半乳糖苷)37℃誘導4h，12％SDS-PAGE電泳，可見一分子量約為70 kDa的蛋白條帶，用抗mtHSP70特異性抗體進行Western blotting雜交檢測，證實該表達蛋白確是PHSP1蛋白。進一步優(yōu)化了外源PHSP1基因在大腸桿菌中的表達條件(IPTG濃度、溫度、時間)，表明0.25mmol/L IPTG、37℃、誘導5h，目的蛋白表達量最高。該外源基因在大腸桿菌BL21(DE3)qb表達量高于ER2566，pET-

3、28a-PHSP1在BL21(DE3)中表達量高于pET-His-PHSP1。 其次，構建了植物表達載體pB1121-PHSP1，將PHSP1置于CaMV35S啟動子控制之下，通過根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105介導，將PHSP1基因轉入煙草葉片組織中。30d后，經(jīng)卡那霉素篩選獲得抗性苗。對獲得的抗性苗進行PCR擴增和Western blotting檢測，證實目的基因成功整合到煙草基因

4、組并得以表達。 對野生型和轉基因煙草進行鹽脅迫處理(0、100、300mmol/L NaCl，時間為0、6、24、48h)，發(fā)現(xiàn)300mmol/L NaCl脅迫48h后，野生型煙草葉片損傷程度較轉基因煙草嚴重。進一步測定葉片SOD(超氧化物歧化酶)、POD(過氧化物酶)活性、CAT(過氧化氫酶)。結果表明，隨著鹽濃度提高及脅迫時間延長，三種酶活性變化不同，但同一處理下，轉基因煙草酶活性始終高于野生型。表明轉PHSPI基因在鹽脅迫