家蠶與果蠅atonal基因功能比較與Atonal結(jié)構(gòu)域分析.pdf

1、神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子在左右后生動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用。這些基因都擁有一個(gè)bHLH結(jié)構(gòu)域,包括負(fù)責(zé)DNA結(jié)合的basic結(jié)構(gòu)域和負(fù)責(zé)蛋白與蛋白之間相互作用的helix-loop-helix結(jié)構(gòu)域。這個(gè)家族的不同成員在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中擔(dān)任不同的角色。神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子atonal(atoDM)是bHLH家族的一個(gè)重要成員,在果蠅的視覺神經(jīng)系統(tǒng)中決定視覺神經(jīng)元的形成。在果蠅眼的發(fā)育過程中,atoDM的功能主要是決定R8基礎(chǔ)視覺神經(jīng)

2、細(xì)胞分化發(fā)育。在ato1,突變體中(無論是ato1純合,還是與缺失突變體Df(3R)p13雜合體),R8基礎(chǔ)視覺神經(jīng)細(xì)胞基本無法形成,或者只有極個(gè)別形成,以致于其后面R1R7視覺神經(jīng)細(xì)胞皆不能形成,最后導(dǎo)致成蟲復(fù)眼的整個(gè)缺失。
　　 在本課題中,我們克隆了家蠶的atonal司源基因,atoDM。atoDMORF為480bp,編碼159個(gè)氨基酸。atoDMC端的bHLH結(jié)構(gòu)域與atoDM的同源性非常高,但兩者N端沒有明顯同源性。我

3、們鑒定了atoDM在家蠶五齡幼蟲眼原基中的表達(dá)時(shí)相。與atoDM的表達(dá)時(shí)相類似,atoDM的mRNA在家蠶五齡幼蟲眼原基中也是呈條帶狀表達(dá)。我們將atoDM按照果蠅內(nèi)源的atonal表達(dá)時(shí)相進(jìn)行異源表達(dá)來補(bǔ)救果蠅ato突變體,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明atoDM可以部分替代atoDM的功能。另外,融合蛋白的補(bǔ)救實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,雖然atoDM的N端序列與atoDM的N端序列沒有明顯的同源性,但卻可以替代它的功能。而bHLH結(jié)構(gòu)域同源性很高,但是atoDM

4、的bHLH區(qū)域替代atoDM HLH區(qū)域的補(bǔ)救效果卻差很多。也就是說bHLH區(qū)域細(xì)微的變化即比整個(gè)N端的替換對(duì)atonal功能的影響更大。這個(gè)結(jié)果說明atonal基因的兩個(gè)區(qū)域在整個(gè)蛋白發(fā)生作用時(shí)擔(dān)任不同的角色,并且bHLH區(qū)域有直接關(guān)系蛋白相互作用的特異氨基酸。
　　 為了進(jìn)一步研究atoanl基因的功能,我們構(gòu)建了不同融合蛋白和截短蛋白,以檢測(cè)atonal基因不同區(qū)域的功能分工。首先,我們用bHLH保守區(qū)單獨(dú)做補(bǔ)救實(shí)驗(yàn),結(jié)果

5、表明bHLH單獨(dú)也可以完成atonal整個(gè)基因的功能,但是效率要差,補(bǔ)救效果沒有用融合蛋白atoBmDm好。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,bHLH可以完成atonal基因的主要功能,但是N端序列也必然有其輔助作用。我們加了不同的功能區(qū)域在bHLH結(jié)構(gòu)域前,然后用這些融合蛋白進(jìn)行補(bǔ)救實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示只有DNA結(jié)合域代替N端區(qū)域時(shí),補(bǔ)救表型才最接近野生型的表型,我們推測(cè)N端序列在atonal基因激活下游基因的過程中可能起到結(jié)合DNA的作用。另外,由于

6、Ato表達(dá)具有嚴(yán)格的時(shí)相性,我們假設(shè)N端序列可能與內(nèi)源Ato蛋白降解相關(guān)。于是我們通過檢測(cè)N端序列連接GFP蛋白的表達(dá)情況,果然檢測(cè)到GFP在系統(tǒng)發(fā)生溝后便有降解。通過軟件預(yù)測(cè),在atonal基因N端序列中存在多個(gè)泛素化位點(diǎn)和sumo化位點(diǎn)。
　　 在這個(gè)課題中,我們除了得到上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,還成功運(yùn)用內(nèi)源atonal的表達(dá)調(diào)控元件構(gòu)建了一個(gè)最接近atonal表達(dá)時(shí)相的GAL4果蠅品系,并且構(gòu)建了兩套不同的atonal基因補(bǔ)救系統(tǒng)。

7、一套是傳統(tǒng)的基于atonal突變體的atonal失活補(bǔ)救體系,另一套是基于RNAi技術(shù)的atonal沉默補(bǔ)救體系。
　　 此外,我們還分析了家蠶神經(jīng)系統(tǒng)中的離子型γ氨基丁酸(GABA)受體基因家族。我們克隆了家蠶GABAR基因家族5個(gè)亞基基因,在已發(fā)表的的昆蟲GABAR家族中是成員數(shù)目最多的,同時(shí)我們還分析了GABAR外顯子的可變剪接形式、截?cái)嗟霓D(zhuǎn)錄本和RNA編輯位點(diǎn)等,發(fā)現(xiàn)鱗翅目昆蟲存在RDL基因的復(fù)制現(xiàn)象,而且RDL基因的R

8、NA編輯位點(diǎn)也是保守的。GABAR在動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中調(diào)節(jié)快速和首要的抑制性神經(jīng)傳遞,是很多農(nóng)藥的作用靶標(biāo)。本研究結(jié)果對(duì)發(fā)展特異性的殺蟲劑具有意義。
　　 此外,我們還分析了家蠶神經(jīng)系統(tǒng)中的離子型γ氨基丁酸(GABA)受體基因家族。家蠶GABAR基因家族在已發(fā)表的的昆蟲GABAR家族中是成員數(shù)目最多的,包括3個(gè)RDL亞基,一個(gè)LCCH3亞基和一個(gè)GRD亞基。另外我們還分析了GABAR外顯子的不同剪接形式。其中家蠶RDL1基因包含RN