豬鏈球菌2型IMPDH基因功能結(jié)構(gòu)域的確定.pdf

1、原創(chuàng)性聲明本人鄭重盧明：所節(jié)交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)F，獨(dú)立進(jìn)行研究J：作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引心的內(nèi)容外，本論文不包食任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰弓過的作品成果。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識(shí)到本盧明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者c需耥虢禮節(jié)件舌月刀日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使川學(xué)位論文的規(guī)定同意學(xué)校保留并向國家有關(guān)部『J或機(jī)構(gòu)送交論文

2、的復(fù)印件和電子版，允許論文被殼閱幣l借閱。本人授權(quán)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采HJ描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。保密口，在一年解密后適用本授權(quán)書。本學(xué)位論文屬于不保(請(qǐng)?jiān)谝陨戏娇騼?nèi)打“4”)學(xué)位論文作者(需親筆)導(dǎo)師(需親筆)簽名：嘛f月乃日州年二月哆日輔鏈球菌2型IMPDH皋州功能結(jié)構(gòu)域的確定豬鏈球菌2型次黃嘌呤核苷酸脫氫酶基因功能結(jié)構(gòu)域的確定摘要豬鏈球菌2型(Streptococcu

3、ssuisserotype2SS2)是我國豬鏈球茵病的重要病原，不僅可引起豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎心內(nèi)膜炎，敗血癥、肺炎和突然死亡，還可感染相關(guān)人員并致死，是一種重要的人畜共患病病原在SS2中，可區(qū)分為強(qiáng)毒株、弱毒株和無毒株，已發(fā)現(xiàn)的毒力因子主要包括溶菌酶釋放蛋白(MRP)、胞外蛋白因子(EF)，溶血素(SLY)，NewORF2，莢膜多糖(CPS)，纖維蛋白原結(jié)合蛋白(FBP)、谷氨酸脫氫酶(GDH)，分泌型核酸(SSnA)和三磷酸甘油醛脫氫酶

4、(GAPDH)等在orf2和mrp之間存在一個(gè)新的開放閱讀框，本課題組通過活性染色已證實(shí)該閱讀框具有次黃嘌呤核苷酸脫氫酶(IMPDH)活性，通過Interpro和PHI)軟件分析IMPDH的結(jié)構(gòu)域模型為【LIVMT]【RK】[LIVM]G一[LIVM]GXG[SEN][LIVMAT]CXT，其中半胱氨酸殘基(C)為底物IMP的結(jié)合部位且已證實(shí)IMPDH基因的融合表達(dá)蛋白可延長(zhǎng)HEp2細(xì)胞的S期。1豬鏈球菌2型次黃嘌呤核苷酸脫氫酶基因的分

5、片段缺失與表達(dá)該閱讀框共有957bp個(gè)堿基，編碼319個(gè)氨基酸，未發(fā)現(xiàn)一個(gè)半胱氨酸殘基(c)通過軟件分析功能結(jié)構(gòu)域存在于第9798bp基因片段所編碼的蛋白質(zhì)中，對(duì)這789bp個(gè)堿基，每次缺失大約200bp以找其酶的催化部位和底物結(jié)合部位按照正確的閱讀順序自行設(shè)計(jì)八對(duì)引物，引物兩端分別添加限制性酶切位點(diǎn)EcoRI、XhoI或NcoI及保護(hù)性堿基，且相應(yīng)的片段通過EcoRI酶切位點(diǎn)去串聯(lián)并克隆至pET32a()栽體中共構(gòu)建五個(gè)重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化

6、至大腸桿菌BL21中，表達(dá)出分子量分別為453kDa，438kDa，426kDa，433kDa的四個(gè)缺失蛋白和一個(gè)分子量為522kDa的全長(zhǎng)蛋白2豬鏈球菌2型IMPDH基因功能結(jié)構(gòu)域的確定豬鏈球菌2型IMPDH基因的分片段缺失克隆和表達(dá)，共原核表達(dá)出五個(gè)融合蛋白。表達(dá)的五個(gè)重組蛋白都含有6個(gè)連續(xù)的組氨酸殘基，利用能與Ni2結(jié)合的特性，進(jìn)行純化五個(gè)重組蛋白經(jīng)NiNTAHisBindResin進(jìn)行非變性條件純化后，獲得相應(yīng)的蛋白免疫轉(zhuǎn)印這4