果蠅GABAB受體C末端Coiled–Coil結(jié)構(gòu)域復(fù)合物的表達(dá)、純化與結(jié)晶.pdf

1、代謝型GABAB受體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ–氨基丁酸的受體，它位于細(xì)胞質(zhì)膜上，屬于C家族G蛋白偶聯(lián)受體，其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)包含N端保外區(qū)、跨膜區(qū)、C端胞內(nèi)區(qū)。人源功能性GABAB受體由GB1與GB2亞基組成異源二聚體復(fù)合物，GB1亞基負(fù)責(zé)結(jié)合配體、GB2亞基負(fù)責(zé)偶聯(lián)G蛋白而開啟下游信號(hào)通路。GB2亞基可以單獨(dú)于細(xì)胞內(nèi)上膜表達(dá)，GB1亞基C末端含有一段內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列，阻止了其單獨(dú)上膜表達(dá)。但是GB1與GB2亞基共同于細(xì)胞中表達(dá)時(shí)

2、，它們的C末端能夠形成具有強(qiáng)烈相互作用的Coiled– Coil超二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而屏蔽了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)對(duì)GB1亞基的影響，使得GB1&GB2異源二聚體能夠正常上膜表達(dá)并行使生理功能。
　　與人源不同的是，果蠅 GABAB受體有 DGB1，DGB2，DGB3三個(gè)亞型，其中已知DGB1與DGB2能夠組成異源二聚體復(fù)合物，DGB3亞基的生理功能尚不清楚。本文首先針對(duì)果蠅GABAB受體DGB1與DGB2亞基C末端氨基酸序列利用生物信息學(xué)手段

3、進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)存在可能形成α螺旋的區(qū)域。之后根據(jù)人與果蠅GABAB受體C末端序列比對(duì)的結(jié)果，并參考已有文獻(xiàn)報(bào)道的人源GABAB受體C末端Coiled– Coil結(jié)構(gòu)域復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)了6組可能存在相互作用的氨基酸序列，全部分別構(gòu)建至His和GST標(biāo)簽的表達(dá)載體中，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行初步的表達(dá)與純化。利用純化得到的蛋白，接下來通過GST–Pull Down實(shí)驗(yàn)確定了兩個(gè)亞基的C末端存在相互作用的氨基酸序列范圍。最