家蠶桿狀病毒bm64基因功能研究.pdf

1、家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus，BmNPV)屬于桿狀病毒科核型多角體病毒屬。家蠶核型多角體病毒（以下簡稱家蠶桿狀病毒）是感染家蠶的重要病原體，我國家蠶養(yǎng)殖業(yè)每年因此遭受巨大經(jīng)濟損失。對于家蠶桿狀病毒基因功能的探索是近些年來研究熱點之一，但是依然存在很多功能未知的基因。
　　本研究就家蠶桿狀病毒的功能未知基因bm64開展研究。通過對NCBI上發(fā)布的BmNPV（T3株）全序列(Ge

2、nBank No.L33180.1)，進行生物信息學分析，尋找bm64基因序列并進行比對和結(jié)構(gòu)域預測。結(jié)果表明bm64與AcMNPV同源序列的同源性高達95％，Bm64蛋白含有一段疏水結(jié)構(gòu)域(62～84 aa)。通過構(gòu)建pGEX-4T-3-bm64，轉(zhuǎn)化至Rosetta菌株，誘導表達Bm64蛋白，親和純化該蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔，獲得多克隆抗體。使用該抗體成功檢測到BmNPV感染BmN細胞后產(chǎn)生Bm64蛋白。通過間接免疫熒光檢測發(fā)

3、現(xiàn)BmNPV感染細胞后Bm64蛋白主要定位于細胞核內(nèi)。因此，推測bm64基因可能在病毒DNA復制和轉(zhuǎn)錄過程中起一定的作用。通過實時定量PCR對該基因的轉(zhuǎn)錄時相進行檢測，發(fā)現(xiàn)bm64基因的轉(zhuǎn)錄時相與晚期基因vp39相似，推測該基因為晚期基因。為闡明bm64基因功能，利用Red同源重組系統(tǒng)和Bacmid桿粒構(gòu)建bm64缺失型重組桿狀病毒，探索其基因缺失對病毒復制的影響。通過Bac-to-Bac系統(tǒng)將bm64基因及其啟動子進行異位補回，構(gòu)建基

4、因回復的重組桿粒。將egfp與ph基因通過Bac-to-Bac系統(tǒng)重組入Bacmid中，構(gòu)建三種不同Bacmid(Bacmid-egfp-ph、Bacmid-△bm64-egfp-ph、Bacmid-bm64rep-egfp-ph)。Western Blot驗證基因缺失重組病毒不表達Bm64蛋白。將三種桿粒轉(zhuǎn)染細胞，發(fā)現(xiàn)bm64基因缺失后重組病毒導致細胞病變的時間明顯延遲，而TCID50檢測也表明病毒滴度下降，而基因補回的重組病毒感染細

5、胞后的病毒滴度達到野生病毒水平。因而，推測bm64基因是病毒復制的非必需基因，但是bm64基因在病毒復制感染中起重要作用。Real-time PCR檢測顯示bm64缺失的重組桿狀病毒的早、晚、極晚期基因lef-3、vp39、p10轉(zhuǎn)錄水平均有不同程度的降低。
　　本研究對bm64基因的轉(zhuǎn)錄時相、原核表達和亞細胞定位等方面進行研究，通過對基因缺失的重組桿狀病毒進行病毒滴度、病毒DNA復制、轉(zhuǎn)錄及蛋白表達檢測，推測bm64基因能影響病