羊肌細(xì)胞生成素(MyoG)基因的克隆、表達(dá)及成肌活性研究.pdf

1、肌細(xì)胞生成素(myogenin,MyoG)是生肌調(diào)節(jié)因子(myogenic regulatory factors,MRFs)家族成員之一,屬于bHLH型蛋白。MyoG主要參與調(diào)解成肌細(xì)胞融合成肌管這一過程,在胚胎發(fā)育期的成肌作用不可替代,其異位表達(dá)可以促使非肌細(xì)胞向肌肉方向分化,并且MyoG基因是MRFs家族中唯一可在所有骨骼肌細(xì)胞系中均可表達(dá)的基因。目前,對該基因的表達(dá)、定位及功能的研究主要集中在小鼠、大鼠、斑馬魚等模式生物上,對羊M

2、yoG生物學(xué)活性以及利用MyoG生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究還未見報(bào)道。因此,本研究通過克隆羊MyoG基因,進(jìn)行體外表達(dá)、亞細(xì)胞定位、成肌活性檢測,為高產(chǎn)肉性能轉(zhuǎn)基因羊生產(chǎn)提供重要參考。主要研究內(nèi)容如下:
　　 1.MyoG基因的克隆及序列分析。利用PCR技術(shù)從湖羊基因組DNA中擴(kuò)增出MyoG基因的三個(gè)外顯子,再通過重疊延伸PCR將外顯子拼接成一段完整ORF,并將其克隆至pMD19-T載體中。酶切及測序結(jié)果均表明pMD19-T-MyoG

3、構(gòu)建正確,MyoG基因ORF正確無誤。序列比對結(jié)果顯示,克隆片段與GenBank上發(fā)表的波爾山羊(FJ607135)、牛(NM-001111325)、豬(NM-001012406)、小鼠(NM-031189)的MyoG基因序列的同源性分別為99.26％、97.04％、92.00％、87.70％。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示,由克隆片段翻譯的氨基酸序列具有典型的bHLH結(jié)構(gòu)。說明克隆的MyoG基因正確無誤,具有發(fā)揮生物學(xué)活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),可以用于后

4、續(xù)研究。
　　 2.重組MyoG的表達(dá)及其亞細(xì)胞定位的研究。構(gòu)建攜帶報(bào)告基因EGFP的融合蛋白表達(dá)載體pEGFP-C1-MyoG,脂質(zhì)體介導(dǎo)體外轉(zhuǎn)染鼠NIH-3T3細(xì)胞、雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)、羊胎兒成纖維細(xì)胞(GEF)。轉(zhuǎn)染48h后,熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光在細(xì)胞中的分布,分析MyoG蛋白在細(xì)胞中的定位情況。同時(shí)提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA及總蛋白,利用RT-PCR、Western Blot檢測融合蛋白在NIH-3T3細(xì)胞內(nèi)的表

5、達(dá)。結(jié)果顯示,RT-PCR、Western Blot均能檢測到融合蛋白的表達(dá),MyoG蛋白在不同物種細(xì)胞中定位無差異,均位于細(xì)胞核中,與生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果一致,
　　 3.MyoG基因成肌活性研究。將前期克隆的羊MyoG基因CDS插入真核表達(dá)載體pcDNA3.0,鑒定正確后,重組載體pcDNA3.0-MyoG體外轉(zhuǎn)染GEF,G418壓力篩選18d后獲得陽性細(xì)胞,擴(kuò)大培養(yǎng),間接免疫熒光(IFA)檢測結(jié)蛋白(Desmin)的表達(dá)

6、,然后更換培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng),觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。結(jié)果IFA能檢測到Desmin的表達(dá),分化培養(yǎng)2d細(xì)胞發(fā)生融合,出現(xiàn)肌管形態(tài),5d后肌管大量出現(xiàn),證明MyoG基因體外具有成肌活性,能誘導(dǎo)非肌細(xì)胞向肌肉分化。
　　 4.體內(nèi)精原干細(xì)胞介導(dǎo)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊。酶切重組質(zhì)粒pEGFP-C1-MyoG使其線性化,利用聚乙烯亞胺(PEI)介導(dǎo),通過隨機(jī)打點(diǎn)法將目的載體注射入公羊睪丸,體內(nèi)轉(zhuǎn)染精原干細(xì)胞(SSCs)。注射公羊與正常母羊自然交配,

7、生產(chǎn)后代,檢測外源基因在F1代基因組中的整合及表達(dá)情況。PCR、DNA斑點(diǎn)雜交結(jié)果表明,外源基因MyoG、EGFP均已整合到后代基因組中,山羊F1代PCR、DNA點(diǎn)雜交陽性率為25.6％(7/27);綿羊Fl代PCR、DNA點(diǎn)雜交陽性率為17.9％(5/28),Western Blot顯示F1代山羊、綿羊各有2頭表達(dá)外源基因,陽性率分別為7.4％(2/27)、7.1％(2/28)。表明睪丸內(nèi)注射法可能是一種簡單有效的生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法