牛Myf6基因克隆及在成肌細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、隨著人們膳食結(jié)構(gòu)的不斷變化及對(duì)健康的日益關(guān)注，牛肉品質(zhì)受到了前所未有的重視，優(yōu)質(zhì)、高檔牛肉供不應(yīng)求。生肌家族控制著整個(gè)肌肉的發(fā)育過程，從前體肌細(xì)胞的定型、增殖以及肌纖維的形成，直到個(gè)體出生后的成熟和功能的完善，都有生肌調(diào)節(jié)因子的參與，直接影響著動(dòng)物的產(chǎn)肉能力與肌肉品質(zhì)。Myf6是生肌家族中的一員，通過深入研究Myf6基因?qū)∪獍l(fā)育的調(diào)控機(jī)制，實(shí)現(xiàn)對(duì)Myf6基因的調(diào)控，就能夠改變肌肉形成過程中肌纖維的性狀，從而提高牛肉品質(zhì)。
　　

2、 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增Myf6基因片段，在質(zhì)粒pIRES2-EGFP的多克隆位點(diǎn)插入Myf6基因構(gòu)建真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-Myf6。脂質(zhì)體技術(shù)轉(zhuǎn)染魯西黃牛成纖維細(xì)胞和成肌細(xì)胞，通過G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。利用westernblot、Real-timePCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后Myf6基因、肌肉肌酸激酶基因和肌球蛋白輕鏈基因的表達(dá)量變化。
　　 本實(shí)驗(yàn)初步建立了脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Myf6轉(zhuǎn)基因技術(shù)，確定了G41

3、8對(duì)成纖維細(xì)胞的最小致死濃度為400μg/ml，對(duì)成肌細(xì)胞的最小致死濃度為600μg/ml，兩種細(xì)胞篩選均獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染后的成纖維細(xì)胞和成肌細(xì)胞中Myf6蛋白和mRNA的表達(dá)量提高（P<0.01），肌肉肌酸激酶基因mRNA表達(dá)量升高（P<0.01），肌球蛋白輕鏈基因的mRNA表達(dá)量也提高（P<0.01）。細(xì)胞形態(tài)觀察顯示轉(zhuǎn)染后的成纖維細(xì)胞沒有形態(tài)變化，未融合為肌管。轉(zhuǎn)染后的成肌細(xì)胞融合為肌管。表明構(gòu)建的真核表達(dá)載體pIRE