RNA干涉對(duì)豬體細(xì)胞肌生成抑制素基因表達(dá)的影響.pdf

1、肌生成抑制素基因(myostatin，MSTN)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)超家族的一員，研究表明，Myostatin基因在抑制骨骼肌的生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)脂肪的積累、肌肉衰竭和再生、骨折愈合等生理活動(dòng)中都發(fā)揮著重要作用。 RNA干涉(RNAinterference，RNAi)是指由雙鏈RNA介導(dǎo)的mRNA的特異性降解反應(yīng)，它首先在秀麗線蟲中被發(fā)現(xiàn)。相關(guān)于RNA干涉的一系列基因沉默現(xiàn)象已在真核王國(guó)中的許多物種中被發(fā)現(xiàn)。這一現(xiàn)象的主要效

2、應(yīng)因子是被稱為小干涉RNA(siRNA)的、21-23bp長(zhǎng)的雙鏈RNA分子。長(zhǎng)的雙鏈RNA分子首先被一種RNA酶Dicer切割成siRNA，然后由這些小分子作為mRNA識(shí)別和切割的模板。RNA干涉將會(huì)成為哺乳動(dòng)物基因功能研究的有力工具。 本研究建立了仔豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞和豬胎兒成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，構(gòu)建了抑制豬MSTN基因表達(dá)的干涉質(zhì)粒。本實(shí)驗(yàn)共選擇了3個(gè)豬肌生成抑制素基因的mRNA干涉位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成三對(duì)特異的寡核苷酸鏈和一對(duì)

3、非特異的寡核苷酸鏈，通過(guò)退火形成雙鏈后依次將其連入帶有U6啟動(dòng)子的干涉載體psiSTRIKE上，得到含四個(gè)目的DNA片段的重組質(zhì)粒。通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將重組干涉質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染仔豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞和豬胎兒成纖維細(xì)胞，并將其分為3組：實(shí)驗(yàn)組、陰性質(zhì)粒對(duì)照組和空白對(duì)照組。經(jīng)過(guò)G418篩選后用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)仔豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞和豬胎兒成纖維細(xì)胞中肌生成抑制素基因mRNA表達(dá)的改變。經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組中肌生成抑制素基