轉(zhuǎn)基因pemG1及HaHR3作物的獲得及功能分析.pdf

1、來(lái)源于稻瘟菌（Magnaporthe grisea）的激活蛋白pemG1能促進(jìn)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，提高棉花煙草的抗病性。棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)是一種危害性非常大的農(nóng)業(yè)害蟲，由于它的取食寄主比較廣泛，每年都給我國(guó)及全世界造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，長(zhǎng)期使用的化學(xué)農(nóng)藥會(huì)使棉鈴蟲產(chǎn)生抗藥性，也會(huì)造成環(huán)境污染。通過(guò)抑制其蛻皮來(lái)達(dá)到殺蟲目的是一條較好的途徑。本實(shí)驗(yàn)選擇的目的基因是棉鈴蟲蛻皮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子激素接受子3基因（HaHR

2、3），它調(diào)控蛻皮過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)，可與DNA上特定的序列結(jié)合，參與蛻皮激素誘導(dǎo)的晚期基因的轉(zhuǎn)錄活性產(chǎn)物的調(diào)控。為探討PemG1蛋白在植物中誘導(dǎo)抗病性和促進(jìn)生長(zhǎng)的功能及通過(guò)應(yīng)用植物介導(dǎo)的RNA干涉基因沉默技術(shù)抑制蛻皮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，阻礙棉鈴蟲幼蟲的正常變態(tài)發(fā)育，生態(tài)調(diào)控棉鈴蟲種群數(shù)量，為棉鈴蟲的有效防治提供一條新的途徑。
　　 本文構(gòu)建了含目的基因pemG1的植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-Ubi-pemG1-Ocs，

3、通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化珂字312和中棉24棉花莖尖和下胚軸，經(jīng)過(guò)一系列組織培養(yǎng)和莖尖離體培養(yǎng)過(guò)程獲得轉(zhuǎn)化了抗性植株，并對(duì)獲得的抗性植株進(jìn)行PCR、測(cè)序、R TPCR、Southern檢測(cè)，確定了轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，并對(duì)陽(yáng)性株進(jìn)行棉花枯萎病菌接種試驗(yàn)，觀察轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)棉花枯萎病的抗性；通過(guò)構(gòu)建好了的含棉鈴蟲蛻皮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子HaHR3基因的正反向RNA干擾載體pCAMBIA-RNAi-HaHR3，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化三生煙葉圓片得到轉(zhuǎn)基因煙草，通

4、過(guò)相關(guān)分子檢測(cè)，鑒定相關(guān)基因在受體植物內(nèi)的整合，轉(zhuǎn)錄，分析轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性狀，這一研究為下一步通過(guò)植物介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)防治棉鈴蟲打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本研究獲得的主要結(jié)果如下：
　　 1.構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-pemG1,pCAMBIA2300-RNAi-HaHR3,該載體含有組成型花椰菜病毒組成型啟動(dòng)子35S，章魚堿合成酶基因終止子以及卡那霉素抗性基因nptⅡ（neomycin phosphotransf

5、ers Ⅱ）。對(duì)載體進(jìn)行了酶切和測(cè)序檢測(cè)，通過(guò)凍融法將載體轉(zhuǎn)化了根癌農(nóng)桿菌（Agrobactrium tumefaciens）菌株LBA-4404,可用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化棉花和煙草。
　　 2.分別通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)pCAMBIA2300-pemG1，pCAMBIA2300-RNAi-HaHR3棉花下胚軸，莖尖，通過(guò)抗生素的濃度篩選及組合，繼代培養(yǎng)基配方的摸索，激素組成的調(diào)節(jié)等，最終得到經(jīng)過(guò)卡那霉素篩選的抗性植株。
　　

6、 3.通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)pCAMBIA2300-RNAi-HaHR3煙草葉圓片法獲得抗性植株，并得到T2代。
　　 4.通過(guò)PCR，PCR產(chǎn)物TA克隆測(cè)序驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株。Southern雜交驗(yàn)證了PemG1，HAHR3在棉花，煙草中的整合，RTPCR驗(yàn)證了pemG1,HaHR3的轉(zhuǎn)錄。
　　 5.比較分析不同激素不同濃度組合的BAP和NAA生長(zhǎng)激素對(duì)莖尖出芽的影響，結(jié)果確定選取0.1 mg/L的BAP和NAA組合最適合芽