中國荷斯坦牛C4A基因的遺傳變異及其作為乳腺炎抗性標(biāo)記的可行性分析.pdf

1、補體成分4(Complement component4，C4)是補體經(jīng)典途徑和凝集素途徑中的一個重要成分，血清含量僅次于C3位居第二。在補體激活和抵抗外源微生物侵入中發(fā)揮著積極作用的C4，主要在肝臟中表達(dá)，一些肝外組織如心臟、肺臟、脾臟、腎臟、大腦、甲狀腺和乳腺中也有表達(dá)。C4是補體系統(tǒng)中多態(tài)含量最高的成分，其結(jié)構(gòu)基因位于主要組織相容性復(fù)合物區(qū)。因此，研究C4意義更顯得重要。
　　 1.C4A基因多態(tài)性與奶牛生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)性分析<

2、br>　　 本研究以1182頭中國荷斯坦牛，利用PCR-RFLP和DNA測序等方法檢測牛C4A基因中未報道的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點，并將發(fā)現(xiàn)的這些SNPs位點及其構(gòu)建的不同單倍型組合與奶牛產(chǎn)奶性狀進行關(guān)聯(lián)性分析，篩查與奶牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，為培育高產(chǎn)奶量、高乳蛋白及高乳脂率奶牛提供參考依據(jù)。通過C4濃度、抗菌活性和補體活性三個指標(biāo)，驗證其抗性效果。
　　 序列分析比對顯示:外顯子10存在g.2994 A＞G突變，

3、外顯子12含g.3508A＞G和g.3649 G＞C突變。試驗群體中SNPs組成的單倍型有8種，滿足統(tǒng)計分析數(shù)量的單倍型組合為7種。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)g.2994 A＞G-AG和g.3649 G＞C-CC個體牛的SCS較其它基因型低(P＜0.01); H5H5(GAC/GAC)為乳腺炎抗性單倍型組合，H2H1(AAG/AAC)是易感性群體。兩種組合對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性差異極顯著(P＜0.001);各基因型C4濃度差異不顯著，但

4、H5H7個體較H5H5高(P＜0.05）。
　　 2.C4A基因可變剪切體的尋找
　　 根據(jù)體細(xì)胞評分和奶樣病原菌鑒定結(jié)果，將6頭奶牛分為健康組和乳腺炎組。利用RT-PCR和克隆測序技術(shù)，在肝臟和乳腺組織中發(fā)現(xiàn)一種形式為內(nèi)含子10保留的可變剪切體，即C4A-AS。兩種轉(zhuǎn)錄本在研究個體的心臟、腎臟、肝臟、脾臟、肺臟、肌肉、乳腺和舌中都有表達(dá)，且在健康奶牛組織中表達(dá)差異極顯著(P＜0.001)，在乳腺炎奶牛中差異不顯著(P=

5、0.257）;乳腺炎發(fā)生時C4A-AS的表達(dá)量顯著增加(P=0.030)。
　　 3.C4A基因啟動子活性分析
　　 利用在線預(yù)測軟件對牛C4A基因的5'側(cè)翼區(qū)序列進行生物信息學(xué)分析，成功構(gòu)建了一系列表達(dá)載體，利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分析牛C4A基因的5'側(cè)翼區(qū)啟動活性。分別通過定點突變技術(shù)構(gòu)建突變質(zhì)粒和脂多糖刺激試驗，研究調(diào)控C4基本表達(dá)和誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。利用EMSA技術(shù)驗證轉(zhuǎn)錄因子在研究細(xì)胞系中存在

6、與否。
　　 C4A基因啟動子序列存在兩個SNP位點，即g.-889 C＞T和g.+147 G＞A。其中，位于內(nèi)含子1的g.+147 G＞A位點與血清C4濃度相關(guān)，可能調(diào)控C4的表達(dá)。C4A基因啟動子序列轉(zhuǎn)錄起始位點上游169 bp為報告基因熒光值最高的片段，即為啟動子核心區(qū);其中SP1(-169～-158)、E-box(-122～-117)和AP-1(-80～-71)是調(diào)控C4基本表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。其中，AP-1在脂