大容量天然人源Fab抗體庫(kù)的構(gòu)建及日本血吸蟲(chóng)抗獨(dú)特型抗體的篩選、鑒定.pdf

1、血吸蟲(chóng)病是一種嚴(yán)重危害人民身體健康的人畜共患寄生蟲(chóng)病。以往的研究證明，以化療為主的血吸蟲(chóng)病防治策略難以達(dá)到阻斷傳播的目的。因此，疫苗成為血吸蟲(chóng)病防治一項(xiàng)優(yōu)先發(fā)展的策略。血吸蟲(chóng)本身有多個(gè)發(fā)育期，抗原成分復(fù)雜多樣，且日本血吸蟲(chóng)80﹪的保護(hù)性抗原為多糖或糖蛋白性質(zhì)，這些糖類抗原表位在血吸蟲(chóng)保護(hù)性免疫及其調(diào)節(jié)方面起著重要作用，但難以用基因工程方法制備。根據(jù)Jerne的免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)，抗獨(dú)特型抗體(anti-id)可通過(guò)其可變區(qū)中的獨(dú)特型表位模擬抗

2、原，誘導(dǎo)出與抗原相似的免疫應(yīng)答。管曉虹等根據(jù)此學(xué)說(shuō)制備了一株日本血吸蟲(chóng)單克隆抗獨(dú)特型抗體NP30，主動(dòng)免疫小鼠、山羊，具有較好的抗感染免疫和抗病免疫功效。但由于NP30為鼠源性抗體，作為異種蛋白用于人體可產(chǎn)生人抗小鼠抗體(humananti-mouseantibody，HAMA)，從而限制了它在人體的應(yīng)用。本文應(yīng)用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)，構(gòu)建大容量天然人源Fab抗體庫(kù)，從中富集、篩選全人源日本血吸蟲(chóng)抗獨(dú)特型抗體并進(jìn)行初步鑒定，為研制可用于人體

3、血吸蟲(chóng)病免疫預(yù)防的抗獨(dú)特型抗體疫苗奠定基礎(chǔ)。 材料與方法1.取15位健康成人骨髓經(jīng)分離后的淋巴細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用一組人特異性引物將VH、VLκ、VLλ基因擴(kuò)增出來(lái)，從質(zhì)粒pComb3XTT和pComb3XSS中將CH1、CLκ和CLλ分別擴(kuò)增出來(lái)。再通過(guò)重疊PCR得到Fab基因片斷，然后將Fab片斷電導(dǎo)入pComb3XTT中，加入培養(yǎng)基、抗生素、輔助噬菌體VCSM13過(guò)夜后，PEG8000沉淀得到天然人源F

4、ab噬菌體抗體庫(kù)。 2.以日本血吸蟲(chóng)可溶性蟲(chóng)卵抗原(SEA)及成蟲(chóng)抗原(SWAP)免疫BALB/c小鼠，使用ProteinGHP純化鼠血清得到IgG，分別以正常鼠血清IgG和免疫鼠血清IgG包板，將建立的抗體庫(kù)依次孵育后進(jìn)行六輪洗脫、富集，從第六輪篩選后得到的細(xì)菌集落中隨機(jī)挑選80個(gè)克隆，用ELISA鑒定，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行可溶性表達(dá)。 研究結(jié)果1.用四對(duì)κ鏈基因引物、九對(duì)λ鏈基因引物和六對(duì)重鏈基因引物擴(kuò)得Fab基因片斷，經(jīng)

5、過(guò)一百次電轉(zhuǎn)化將其導(dǎo)入E.coliXLI-Blue菌中，構(gòu)建了庫(kù)容為2×109的全人源Fab噬菌體抗體庫(kù)。 2.以純化鼠血清IgG為抗原進(jìn)行了六輪富集篩選，從全人源Fab噬菌體抗體庫(kù)中篩選出抗獨(dú)特型噬菌體抗體并進(jìn)行富集。每一輪篩選后，噬菌體抗體收獲率均有增加，第六輪篩選的噬菌體抗體收獲率較第一輪提高了1.4×104倍。 3.經(jīng)ELISA鑒定出四株(C12、C19、D1、D2)抗獨(dú)特型抗體。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)其中一株(C12

6、)表達(dá)可溶性抗體。經(jīng)SDS-PAGE電泳，在相對(duì)分子量50KD和25KD處出現(xiàn)兩條較明顯的表達(dá)帶，為Fab-Histag融合蛋白。 研究結(jié)論1.成功構(gòu)建了大容量天然人源Fab抗體庫(kù)，為今后制備針對(duì)各種抗原的全人抗體提供了一個(gè)技術(shù)平臺(tái)。 2.從上述庫(kù)中篩選獲得四株日本血吸蟲(chóng)抗獨(dú)特型抗體，對(duì)其中一株(C12)進(jìn)行了可溶性表達(dá)，并經(jīng)SDS-PAGE電泳初步鑒定，為制備可用于人體血吸蟲(chóng)病免疫預(yù)防的抗獨(dú)特型抗體疫苗候選分子奠定了基