豚鼠氣單胞菌單克隆抗體及抗獨特型單克隆抗體的制備及鑒定.pdf

1、豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)是養(yǎng)殖及野生魚、蝦、蛙、甲魚等生物常見的細菌性病原體，可通過受損傷的皮膚及傷口感染上述生物，并可進一步通過食物鏈感染人。此菌所致魚類等豚鼠氣單胞菌病具有流行廣、發(fā)病快、死亡率高等特點，常常造成養(yǎng)殖漁業(yè)的巨大經(jīng)濟損失，嚴重危害漁業(yè)及其它水產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前國內(nèi)外有關(guān)豚鼠氣單胞菌魚病的研究多局限于病原微生物學方面，對該病的診斷主要依靠臨診病理觀察及細菌學鑒定，兩種方法在準確性及檢測速度上均有一定限

2、制；防治方面主要利用抗生素或減活、滅活疫苗，安全性和有效性均不理想。鑒于此，本研究設(shè)計制備抗豚鼠氣單胞菌單克隆抗體并進而制備其獨特型單克隆抗體，為豚鼠氣單胞菌病的檢測及防治提供新的技術(shù)方法，并為其它魚用疫苗的研制提供參考。具體實驗方法及結(jié)果如下： (1)通過動物免疫、細胞融合、篩選、克隆化及利用ELISA檢測技術(shù)，制備并鑒定抗豚鼠氣單胞菌的單克隆抗體(mAb)。共得到7株能穩(wěn)定分泌mAb的細胞株，分別命名為：0E10、1A2、1

3、C4、1F1、1F10、1H8和2A1。染色體鑒定結(jié)果7株細胞染色體均符合雜交瘤細胞染色DepartmentofHistologyandembryology,FMMU,Xi'an第4頁體特點。雜交瘤細胞株培養(yǎng)上清液及BALB/c小鼠腹水中mAbs效價范圍為1×10-2～1×10-3和1×10-3～1×10-5，亞類鑒定顯示：1F1屬于IgG1，1C4、1F10和1H8屬于IgG2a，2A1屬于IgG2b，0E10和1A21屬于IgG3,

4、交叉實驗結(jié)果顯示各株單克隆抗體與氣單胞菌屬內(nèi)另兩種常見致魚病性細菌嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌，以及其他四種常見致魚病性細菌鰻弧菌、遲緩愛德華菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌等均不發(fā)生交叉反應(yīng)，表明所制備的各株單克隆抗體均具有較好的特異性，可用于豚鼠氣單胞菌的檢測及進一步研究。 (2)利用自制的單抗作為一抗，通過免疫組織化學SABC法對涂于玻片上的豚鼠氣單胞菌進行免疫組織化學染色。結(jié)果顯示：豚鼠氣單胞菌菌體呈稍彎的短桿狀，兩端鈍園，菌體周圍

5、呈深棕色，中央不著色，陰性對照呈陰性反應(yīng)。上述結(jié)果說明自制的單抗針對的是豚鼠氣單胞菌的表面抗原，利用自制的單抗通過免疫組織化學染色方法可特異性地檢測豚鼠氣單胞菌。 (3)以豚鼠氣單胞菌感染龍睛蝶尾金魚為模型，對制備的5株抗豚鼠氣單胞菌單抗的治療保護效果進行研究。結(jié)果表明：單抗1F1能提高受10LD50劑量豚鼠氣單胞菌感染金魚的存活率，其保護率為62.50％，對金魚具有明顯保護效果。上述結(jié)果提示單抗1F1所針對的可能是豚鼠氣單胞菌

6、的中和性抗原表位，具有免疫中和或減弱細菌毒性的作用，可用作魚類豚鼠氣單胞菌感染的中和性抗體治療制劑，也可作為制備豚鼠氣單胞菌抗獨特型抗體的理想候選單克隆抗體。 (4)利用自制的具有免疫中和活性的抗豚鼠氣單胞菌單克隆抗體1F1，通過動物免疫、細胞融合、篩選和克隆化，獲得4株分泌抗獨特型抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為1E12、4F6、6G6和7C1。雜交瘤細胞株的培養(yǎng)上清液及BALB/c小鼠腹水中抗獨特型抗體效價范圍 Dep

7、artmentofHistologyandembryology,FMMU,Xi'an第5頁分別為1×10-1～1×10-2和1×10-3～1×10-4。ELISA競爭抑制實驗結(jié)果顯示：4株抗獨特型抗體與兔抗豚鼠氣單胞菌多克隆抗體的結(jié)合都能被豚鼠氣單胞菌抑制，而且抑制百分率隨著豚鼠氣單胞菌濃度的增加而增加，說明4株豚鼠氣單胞菌抗獨特型單克隆抗體與豚鼠氣單胞菌之間存在相互競爭關(guān)系，均具有模擬豚鼠氣單胞菌抗原的特性。抑制百分率結(jié)果顯示6G6受

8、抑制程度比其余3株受抑制程度高，推測其模擬豚鼠氣單胞菌抗原的活性最好。生物學功能鑒定結(jié)果表明，制備4株豚鼠氣單胞菌抗獨特型單克隆抗體腹水的BALB/c小鼠血清均能與豚鼠氣單胞菌反應(yīng)，效價為1∶50～1∶800，說明上述小鼠血清中含有抗豚鼠氣單胞菌抗體，提示4株豚鼠氣單胞菌抗獨特型單克隆抗體均具有模擬豚鼠氣單胞菌抗原表位的作用，可用作預防魚類豚鼠氣單胞菌病的疫苗。 綜上所述，本研究利用雜交瘤技術(shù)制備出多株抗豚鼠氣單胞菌的單克隆抗體