抗對蝦白斑癥病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28獨特型單克隆抗體的研制與應(yīng)用.pdf

1、對蝦白斑癥病毒(WSSV)病是危害養(yǎng)殖對蝦最嚴重的病害之一，自該病1993年暴發(fā)以來，在對其病原、病理、檢測及診斷技術(shù)等方面的研究上取得了諸多成果。目前，研究WSSV感染的分子機理，尋求防控WSSV感染的方法已成為熱點。已有研究表明WSSV-VP28在WSSV的感染入侵過程中起著非常重要的作用。
　　 論文純化了前期制備的具有中和WSSV特性的抗VP28單克隆抗體(單抗)1D6(Ab1)，并以之為抗原免疫小鼠，研制抗VP28獨特

2、型單抗(Ab2)雜交瘤細胞，利用間接酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)和競爭ELISA，從中篩選到一株單抗A1A5，該單抗能與WSSV競爭結(jié)合抗VP28抗體；以抗-抗獨特型抗體(Ab3)進一步分析單抗A1A5的特性，證實了單抗A1A5是能模擬VP28的抗VP28獨特型單抗；利用研制的抗VP28獨特型單抗研究了VP28與宿主細胞間的相互作用，檢測了VP28與中國對蝦組織的結(jié)合，鑒定了VP28在中國對蝦血細胞上的結(jié)合蛋白，為進一步確認VP28在

3、WSSV感染中所起的作用，深入研究WSSV感染機理，切斷WSSV感染途徑提供新的依據(jù)。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 (1)抗VP28獨特型單抗的研制。以前期已制備的具有中和WSSV特性的抗VP28單抗1D6雜交瘤細胞生產(chǎn)腹水，腹水依次經(jīng)辛酸-硫酸銨法和Protein G親和層析純化，獲得了純度高、有活性的抗VP28中和單抗并用以免疫BALB/c小鼠，利用細胞融合技術(shù)，研制抗VP28獨特型單抗雜交瘤細胞，采用間接ELISA和競爭

4、ELISA方法從雜交瘤細胞中篩選抗VP28獨特型單抗，克隆得到1株抗VP28獨特型單抗A1A5能識別抗VP28抗體，并能與WSSV競爭結(jié)合抗VP28抗體，初步證實單抗A1A5能模擬VP28的抗原構(gòu)象。
　　 (2)以抗-抗獨特型抗體分析抗VP28獨特型單抗的特性。為了進一步確認單抗A1A5的特性，以A1A5雜交瘤細胞生產(chǎn)腹水，腹水經(jīng)辛酸-硫酸銨法和ProteinG親和層析純化，獲得純化抗體用以免疫BALB/c小鼠制備抗血清，得到

5、Ab3；采用間接免疫熒光分析(ⅡFA)、金標免疫電鏡法(IEM)、競爭ELISA和螯蝦體內(nèi)中和實驗多種方法分析了Ab3特性。ⅡFA證實Ab3可與感染W(wǎng)SSV的蝦鰓反應(yīng)；IEM結(jié)果顯示Ab3可與WSSV結(jié)合，其結(jié)合位點位于WSSV囊膜上；競爭ELISA表明Ab3能與抗VP28抗體競爭結(jié)合WSSV上結(jié)合位點；以螯蝦體內(nèi)中和實驗分析Ab3中和性，注射與Ab3孵育后WSSV的螯蝦與僅注射WSSV的螯蝦相比，其死亡時間明顯延遲，證實Ab3能中和W

6、SSV感染。以上結(jié)果說明了由Ab2免疫產(chǎn)生的抗體Ab3具有與類似Ab1特性。因此，根據(jù)抗獨特型抗體理論推斷，單抗A1A5是能模擬VP28的抗VP28獨特型單抗。
　　 (3)抗VP28獨特型單抗的應(yīng)用。論文在成功研制抗VP28獨特型單抗的基礎(chǔ)上，利用抗VP28獨特型單抗探討了WSSV囊膜蛋白VP28與宿主細胞之間的相互作用關(guān)系。中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)血細胞與單抗A1A5孵育，再以熒光二抗染色

7、，在中國對蝦血細胞膜上可見黃綠色熒光，結(jié)果表明單抗A1A5能與中國對蝦血細胞膜結(jié)合，中國對蝦血細胞膜上存在VP28的受體蛋白。以辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗WSSV混合單抗，建立了基于斑點免疫印跡(Dot-blot)和ELISA的WSSV與血細胞膜體外結(jié)合實驗體系，提純的血細胞膜固定于NC膜或酶標板上，將單抗A1A5或抗中國對蝦血細胞顆粒單抗1G8與中國對蝦血細胞膜作用后，再與WSSV孵育，結(jié)果顯示A1A5組的WSSV結(jié)合量明顯低于

8、1G8組，單抗A1A5與中國對蝦血細胞膜的結(jié)合能部分阻斷WSSV與中國對蝦血細胞膜的結(jié)合，這為證明VP28是WSSV感染相關(guān)的重要蛋白提供了新的依據(jù)。以ⅡFA和免疫組織化學方法(IHC)檢測單抗A1A5與中國對蝦各組織的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)單抗A1A5可以與中國對蝦鰓和腸組織結(jié)合，而不與肌肉、性腺、心臟、肝胰腺等組織結(jié)合，推斷中國對蝦鰓和腸組織中存在VP28的受體蛋白。以免疫共沉淀鑒定VP28在中國對蝦血細胞上的結(jié)合蛋白，單抗A1A5可與中國對蝦