黃綠木霉和球孢白僵菌幾丁質(zhì)降解酶基因的克隆與表達(dá).pdf

1、幾丁質(zhì)降解酶是一組能降解幾丁質(zhì)，生成幾丁低聚糖的酶的總稱。幾丁質(zhì)是由β-1，4糖苷鍵連接的N-乙酰氨基葡萄糖的多聚物，是儲(chǔ)量?jī)H次于纖維素的第二大生物資源。本文通過基因工程的方法克隆幾丁質(zhì)降解酶基因，轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，為大量生產(chǎn)幾丁質(zhì)降解酶奠定基礎(chǔ)。 黃綠木霉(Trichodermaaureoviride)和球孢白僵菌(Beauveriabassiana)是自然界普遍存在的真菌，具有高效的幾丁質(zhì)降解酶體系。本文以黃綠木霉(T.aur

2、eoviride)和球孢白僵菌(B.bassiana)為出發(fā)菌株；采用PCR方法克隆到黃綠木霉(T.aureoviride)和球孢白僵菌(B.bassiana)幾丁質(zhì)降解酶基因ech42、chit1、chit2和cns1DNA片段，測(cè)序后將這些基因DNA片段構(gòu)建到釀酒酵母(S.cerevisiae)誘導(dǎo)型表達(dá)載體pYES2上，轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)化子經(jīng)誘導(dǎo)，用Northern雜交驗(yàn)證了目的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。采用DNS法，分別以膠態(tài)幾丁質(zhì)為底物，研

3、究了各個(gè)轉(zhuǎn)化子的酶活性、培養(yǎng)周期，重組酶的最適溫度和pH值，以及重組酶的協(xié)同作用。 本文從黃綠木霉(T.aureoviride)和球孢白僵菌(B.bassiana)菌株的DNA中，通過引物設(shè)計(jì)，用PCR方法克隆得到了ech42、chit1、chit2、cns1的DNA片段，共4個(gè)基因片段。對(duì)其中的DNA片段進(jìn)行測(cè)序，證實(shí)得到了全部是幾丁質(zhì)降解酶基因的DNA片段。來源于黃綠木霉的幾丁質(zhì)酶基因ech42序列遞交國(guó)際權(quán)威基因數(shù)據(jù)庫(kù)Ge

4、nBank，經(jīng)審核確認(rèn)沒有與數(shù)據(jù)庫(kù)中重復(fù)的序列后，將該序列在數(shù)據(jù)庫(kù)上發(fā)表，序列號(hào)為AY850032。添補(bǔ)了國(guó)際權(quán)威基因數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank在黃綠木霉幾丁質(zhì)酶基因這一內(nèi)容上的空白。 將克隆到的4個(gè)目的基因構(gòu)建到帶有高效啟動(dòng)子的釀酒酵母表達(dá)載體pYES2上，得到4個(gè)重組質(zhì)粒。用釀酒酵母完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化法將以上4個(gè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入釀酒酵母(S.cerevisiae)H158細(xì)胞中，通過釀酒酵母菌落PCR和雙酶切鑒定證實(shí)了轉(zhuǎn)化的成功，得到了帶有

5、4種幾丁質(zhì)降解酶基因DNA片段的釀酒酵母(S.cerevisiae)H158轉(zhuǎn)化子。 對(duì)轉(zhuǎn)化子的Northern雜交檢測(cè)分別得到了與預(yù)期大小相符的雜交信號(hào)帶，證實(shí)了各個(gè)幾丁質(zhì)降解酶基因DNA片段在GAL1啟動(dòng)子控制下經(jīng)半乳糖誘導(dǎo)在釀酒酵母(S.cerevisiae)中成功轉(zhuǎn)錄表達(dá)；并通過DNS法研究了各個(gè)轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵周期，發(fā)現(xiàn)ech42、chit1、chit2和cns1轉(zhuǎn)化子產(chǎn)酶高峰的出現(xiàn)時(shí)間分別為36h、48h、36h和48h

6、(接種量為5mL)，各轉(zhuǎn)化子酶活的最大值分別為0.50、0.47、0.63、和0.62UmL-1；各重組酶的最適反應(yīng)溫度分別為Ech4240℃、Chit170℃、Chit270℃、Cns170℃各重組酶的最適pH值分別為Ech42g.0、Chit18.0、Chit25.0、Cns14.6。比較了在相同條件下4種轉(zhuǎn)化子分泌的重組酶的協(xié)同作用，結(jié)果表明在相同條件下4種重組酶不同組合的酶活差異十分顯著。在所有的組合當(dāng)中，Cns1和chit1組

7、合的酶活最高0.75UmL-1，Chit1和Chit2組合酶活最低0.21UmL-1。重組酶Ech42和Cns1與其它重組酶之間存在正協(xié)同效應(yīng)，Chit1和Chit2之間是負(fù)協(xié)同效應(yīng)。 黃綠木霉(T.aureoviride)和球孢白僵菌(B.bassiana)的幾丁質(zhì)降解酶基因DNA片段的克隆，為進(jìn)一步研究幾丁質(zhì)降解酶基因在釀酒酵母(S.cerevisiae)等其他細(xì)胞中的表達(dá)及重組酶的特性提供了重要的材料；為其他有關(guān)抗病抗蟲基

8、因工程提供了重要基因資源。通過對(duì)轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵周期和重組酶的酶學(xué)特性分析證實(shí)了釀酒酵母(S.cerevisiae)可以正確表達(dá)黃綠木霉(T.aureoviride)和球孢白僵菌(B.bassiana)的幾丁質(zhì)降解酶基因的DNA片段，為構(gòu)建可大量生產(chǎn)幾丁質(zhì)降解酶的酵母工程菌提供了重要理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)中四種幾丁質(zhì)降解酶存在不同的協(xié)同作用的結(jié)果，為進(jìn)一步研究其他不同的幾丁質(zhì)降解酶組合的協(xié)同作用提供了新的思路，對(duì)進(jìn)一步研究幾丁質(zhì)降解酶的實(shí)際應(yīng)用具有