四倍體鯽鯉BAC文庫(kù)構(gòu)建及其演化分析.pdf

1、異源四倍體鯽鯉(Allotetraploid crucian-carp，簡(jiǎn)稱AT)是通過(guò)紅鯽(Carassius auratus red var.，♀)與鯉魚(yú)(Cyprinus carpio L.，())遠(yuǎn)緣雜交首次在脊椎動(dòng)物中人工培育的兩性可育、遺傳性狀穩(wěn)定的四倍體魚(yú)。目前該四倍體鯽鯉品系目前已繁殖到第18代，形成了一個(gè)龐大的新型四倍體鯽鯉魚(yú)群體，該群體的形成在魚(yú)類演化和魚(yú)類遺傳育種具有重要意義。研究表明，四倍體鯽鯉與其二倍體父母本在

2、基因型和表現(xiàn)型均發(fā)生了改變。因此，有必要從基因組和轉(zhuǎn)錄組水平對(duì)其生物學(xué)特征進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究，并深入分析功能基因的篩選、遺傳標(biāo)志的發(fā)現(xiàn)定位及經(jīng)濟(jì)形狀與基因功能關(guān)聯(lián)連鎖確定。并可為魚(yú)類多倍化形成機(jī)制提供新的信息，最終為魚(yú)類分子設(shè)計(jì)育種提供一個(gè)技術(shù)服務(wù)指導(dǎo)性平臺(tái)。
　　 本研究對(duì)F18異源四倍體鯽鯉新品系進(jìn)行了BAC文庫(kù)構(gòu)建及鑒定，對(duì)F18四倍體鯽鯉、紅鯽魚(yú)和鯉魚(yú)的肝臟轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量測(cè)序研究、并對(duì)轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得

3、的主要研究結(jié)果如下：
　　 1、首次構(gòu)建新品系異源四倍體鯽鯉的BAC文庫(kù)，該文庫(kù)包含43200個(gè)克隆。構(gòu)建BAC文庫(kù)采用全血細(xì)胞包埋瓊脂糖法制備HMWDNA，經(jīng)HindⅢ限制性酶切，脈沖場(chǎng)電泳(PFGE)分離選擇獲得150-300kb的DNA片段，通過(guò)電洗脫和透析純化HMW DNA，連接到線性磷酸化的克隆載體p CC1BAC上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。對(duì)構(gòu)建的BAC文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)量鑒定評(píng)估，插入DNA片段大小在110-310kb之間，平均

4、插入片段大小為190kb左右，具有約2.6倍左右的基因組覆蓋率。獲得的BAC文庫(kù)克隆，保存在450塊96孔板中，存放在-80℃冰柜備用。所建立的BAC文庫(kù)基本能滿足功能基因篩選、基因定位、進(jìn)化機(jī)制、數(shù)量形狀連鎖分析及轉(zhuǎn)基因等研究的需要。
　　 2、異源四倍體鯽鯉、紅鯽和鯉魚(yú)的肝臟轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共得到異源四倍體鯽鯉原始數(shù)據(jù)1.2GB，紅鯽原始數(shù)據(jù)934MB，鯉魚(yú)原始數(shù)據(jù)為1.1GB，用CLC BIO軟件對(duì)F18異源四倍體鯽鯉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

5、經(jīng)基本處理后產(chǎn)生Unigene數(shù)為9554條。
　　 3、使用EDEGR對(duì)F18與紅鯽拼接好的contigs進(jìn)行基因差異表達(dá)分析(閾值設(shè)定為logFC>2)，結(jié)果顯示：F18與紅鯽相比，在肝臟轉(zhuǎn)錄組中6192個(gè)contigs表達(dá)上調(diào)(logFC>2，P<0.05)，有217個(gè)contigs表達(dá)下調(diào)(logFC>2，P<0.05)。F18與鯉魚(yú)相比，在肝臟轉(zhuǎn)錄組中4867個(gè)contigs表達(dá)上調(diào)(logFC>2，P<0.05)，有

6、578個(gè)contigs表達(dá)下調(diào)(logFC>2，P<0.05)。
　　 4、F18與紅鯽和鯉魚(yú)肝臟相比有差異contigs通過(guò)KEGG代謝途徑分析其功能差異。發(fā)現(xiàn)上調(diào)的基因主要在碳水化合物代謝、氨基酸代謝、脂代謝和能量代謝作用途徑中。GO分析表明，在分子生物學(xué)功能層次中binding和catalytic activity的差異基因占主要部分。在細(xì)胞組成水平層次中cytoplasm和organelle占主要部分。在生物過(guò)程層次中，

7、metabolic process和regulation of biological process的差異表達(dá)基因最多。
　　 5、與紅鯽的轉(zhuǎn)錄組及鯉魚(yú)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行SV(structure variation)分析，結(jié)果表明：在異源四倍體鯽鯉的Unigenes中有185條Unigenes與紅鯽轉(zhuǎn)錄組的contig有基因融合，有192條Unigenes與鯉魚(yú)轉(zhuǎn)錄組的contig有基因融合。有24條Unigenes包含有紅鯽、鯉魚(yú)的基

8、因片段。
　　 6、對(duì)F18與紅鯽和鯉魚(yú)肝臟轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行SNP分析，首次發(fā)現(xiàn)：對(duì)比F18和紅鯽，共發(fā)現(xiàn)有SNP位點(diǎn)46449個(gè)；而與鯉魚(yú)相比其SNP位點(diǎn)共發(fā)現(xiàn)有59436個(gè)。相比較于紅鯽，F(xiàn)18與父本鯉魚(yú)的遺傳變異位點(diǎn)更多，證明了F18偏母性遺傳的特征。其中A型轉(zhuǎn)鐵蛋白transferrin variantA和MHC classⅠ antigen的變異位點(diǎn)較多，提示這兩個(gè)基因在F18中發(fā)生的變化較大，這可能對(duì)其抗逆能力的增加有作用

9、。
　　 7、Transferrin variant A和MHC classⅠ antigen的演化分析；從transferrin variant A構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)可以看出，該基因F18更偏向紅鯽，與紅鯽聚為一支，而與鯉魚(yú)相差較大；從MHC classⅠ antigen構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)可以看出，F(xiàn)18的MHC classⅠ antigen從序列上看更偏向鯉魚(yú)，而與紅鯽差異較大。從分子水平說(shuō)明多倍體化過(guò)程中，基因偏向性選擇，每個(gè)基因面對(duì)