雙白術(shù)內(nèi)酯的分離及其抑制AChE的作用機制研究.pdf

1、目的:從中藥浙白術(shù)中提取分離得到雙白術(shù)內(nèi)酯，探討雙白術(shù)內(nèi)酯抑制AChE的作用機制，為進一步開發(fā)雙白術(shù)內(nèi)酯成為抗AD藥物提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、雙白術(shù)內(nèi)酯的提取分離:采用乙酸乙酯浸漬提取生浙白術(shù)，用色譜分離技術(shù)對其化學(xué)成進行分離，通過1H-NMR,13C-NMR技術(shù)進行化合物分子結(jié)構(gòu)確證。分離得到一系列化合物包括雙白術(shù)內(nèi)酯。
　　2、分子對接研究:運用MOE分子對接軟件將雙白術(shù)內(nèi)酯分子與AChE蛋白進行分子對

2、接，明確它們相互之間的分子作用位點。
　　3、雙白術(shù)內(nèi)酯抑制AChE活性研究:采用Ellman法評價雙白術(shù)內(nèi)酯對AChE抑制活性，得到不同濃度雙白術(shù)內(nèi)酯對AChE的抑制率，繪制雙白術(shù)內(nèi)酯對AChE抑制率的量效曲線圖，得到一個擬合的曲線方程，求出IC50值。
　　4、雙白術(shù)內(nèi)酯抑制AChE的表達研究:將AChE-S基因與GSK-3β基因轉(zhuǎn)染到敲除了GSK-3β的MEF細胞與293T細胞中，加入不同濃度的雙白術(shù)內(nèi)酯后培養(yǎng)細胞24

3、 h后，通過蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)觀察雙白術(shù)內(nèi)酯在MEF細胞和293T細胞中對AChE的表達水平的影響，探討其作用機制。
　　結(jié)果:
　　1、從白術(shù)的乙酸乙酯提取物中初步分離經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定得到了10個化合物，分別為白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ(3000 mg)，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ(800 mg)，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ(7000 mg)，雙白術(shù)內(nèi)酯(480 mg)，蒲公英萜醇乙酸酯(240mg)，杜松腦(180 mg)，二十八烷酸(50mg)，β-谷甾醇(380 mg)

4、，十七烷酸(600 mg)，7-α-羥基-β-谷甾醇(9.8 mg)。
　　2、分子對接研究表明雙白術(shù)內(nèi)酯可以與AChE蛋白的PAS活性部位中的Trp279通過H-π(3.31(A))的作用結(jié)合;與CAS活性部位中的Trp84形成H-π(3.88(A))的作用，RMSD=1.14(A)，表明雙白術(shù)內(nèi)酯與AChE穩(wěn)定結(jié)合，且分子對接體系穩(wěn)定性良好。
　　3、雙白術(shù)內(nèi)酯可以有效的抑制AChE水解ACh的活性，一定濃度范圍內(nèi)雙白術(shù)

5、內(nèi)酯對AChE抑制率有一定的量效關(guān)系，構(gòu)建了一個量效曲線方程:y=-0.33x2+9.14x+6.99(R2=0.9874)，IC50值為14.1685μM。
　　4、雙白術(shù)內(nèi)酯可以下調(diào)MEF細胞中的AChE的表達，也可以下調(diào)293T細胞中的AChE的表達，且具有劑量依賴性。
　　結(jié)論:采用乙酸乙酯浸漬提取浙白術(shù)，分離得到了雙白術(shù)內(nèi)酯，并且其產(chǎn)率明顯高于文獻報道的產(chǎn)率。雙白術(shù)內(nèi)酯抑制AChE的作用機制是通過與AChE結(jié)合抑制