蠟梅金屬硫蛋白基因的克隆、表達與功能分析.pdf

1、金屬硫蛋白(metallothionein，MT)是一類富含Cys能夠結(jié)合重金屬的低分子量蛋白質(zhì)，廣泛分布于生物界。近來對金屬硫蛋白的研究日益深入，越來越多的金屬硫蛋白基因被發(fā)現(xiàn)并克隆。很多研究表明，金屬硫蛋白可能具有清除自由基、重金屬解毒、抗衰老、抗輻射、修復(fù)組織損傷和調(diào)節(jié)微量元素平衡的功能。還可能與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、細胞的增殖與凋亡密切相關(guān)。動物金屬硫蛋白由于發(fā)現(xiàn)較早，目前已研究得較深入，而植物金屬硫蛋白發(fā)現(xiàn)相對較晚，進展也相對緩

2、慢。本文從本實驗室構(gòu)建的蠟梅花cDNA文庫中克隆了一個金屬硫蛋白基因，構(gòu)建了原核表達載體誘導(dǎo)融合蛋白表達，并用His-Bind蛋白純化回收試劑盒對其進行純化回收，得到了蠟梅金屬硫蛋白，并對其功能進行了初步驗證，為以后研究奠定基礎(chǔ)。
　　 1.蠟梅金屬硫蛋白基因CpMT的克隆
　　 本文在構(gòu)建好的蠟梅花cDNA文庫的基礎(chǔ)上，通過隨機克隆測序克隆得到了1個蠟梅金屬硫蛋白的cDNA，將其命名為CpMetallothionein

3、(CpMT)。CpMT cDNA全長為1083 bp，基因內(nèi)部含有一個長度為240 bp的可編碼79個氨基酸殘基的開放閱讀框(ORF)。
　　 2.CpMT基因編碼的蛋白質(zhì)性質(zhì)分析
　　 運用生物信息學(xué)手段對CpMT基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特點與性質(zhì)進行了分析，最大ORF編碼的79個氨基酸分子量約為7765.95 D，等電點為4.67，共6個磷酸化位點。在NCBI上進行基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析后發(fā)現(xiàn)其保守結(jié)構(gòu)域同MTs有部分相

4、似性。表明其編碼蛋白質(zhì)具有MT-like proteins結(jié)構(gòu)域，屬于MT-like proteins蛋白家族。
　　 3.CpMT基因原核表達載體的構(gòu)建與原核表達體系的優(yōu)化
　　 根據(jù)目的基因和載體特點設(shè)計引物，經(jīng)PCR擴增、酶切、連接和轉(zhuǎn)化等操作將蠟梅金屬硫蛋白基因和原核表達載體pET-32a片段連接，成功構(gòu)建原核表達載體PET32-CpMT。并轉(zhuǎn)化到Origami2感受態(tài)細胞中誘導(dǎo)表達，獲得了融合蛋白，融合蛋白分子

5、量約為29kD。從誘導(dǎo)溫度、IPTG終濃度和誘導(dǎo)表達時間三個方面優(yōu)化重組蛋白的表達體系，經(jīng)SDS-PAGE電泳確認表達的融合蛋白以包涵體和可溶性蛋白兩種形式存在。
　　 4.CpMT基因功能初步分析
　　 首先進行了轉(zhuǎn)化菌重金屬耐受性實驗，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化菌較對照菌有更好的重金屬耐受性。為了進一步驗證其功能，構(gòu)建了植物表達載體PC2301-CpMT，并轉(zhuǎn)化到煙草中，經(jīng)GUS染色檢測和PCR檢測，證明轉(zhuǎn)化成功獲得轉(zhuǎn)基因植株。對