西湖水及其它環(huán)境中洋蔥伯克氏菌的多樣性及其致病性研究.pdf

1、洋蔥伯克氏菌群(Burkholderia cepacia complex,Bee)的細(xì)菌主要存在于水體、醫(yī)院和農(nóng)業(yè)環(huán)境中,雖然部分Bcc被認(rèn)為是有益菌,但不少是世界公認(rèn)的植物和人體致病菌。了解水體、醫(yī)院和一些植物上的Bcc菌的種類及其遺傳多樣性,對(duì)我國(guó)Bcc菌的利用與環(huán)境安全極其重要。然而,國(guó)內(nèi)外尚無(wú)這類詳細(xì)的研究報(bào)道。本研究以西湖水為主要研究對(duì)象,對(duì)水中的Bcc種類及其動(dòng)態(tài)作了較深入研究;并從醫(yī)院環(huán)境中獲得的細(xì)菌中篩選出Bcc菌,調(diào)查

2、了我國(guó)一些醫(yī)院環(huán)境中主要存在的Bee種;同時(shí)對(duì)由Bee菌引起的杏果新病害--杏果腐病作了研究。對(duì)西湖水、醫(yī)院及杏果中所獲得的Bcc菌的種類、致病性及其致病基因進(jìn)行了比較研究,同時(shí)針對(duì)Bcc菌抗藥性強(qiáng)和防治難的特點(diǎn),本研究還對(duì)防治Bcc菌的新物質(zhì)進(jìn)行了探索。取得了如下的主要研究結(jié)果:
　　 (1)采用培養(yǎng)和非培養(yǎng)的分子檢測(cè)方法,在為期一年的時(shí)間內(nèi)定點(diǎn)定時(shí)對(duì)西湖水中的Bcc菌種類及其遺傳多態(tài)性作了研究;同時(shí)與來(lái)自醫(yī)院和杏果Bcc菌進(jìn)

3、行了分析和比較。通過(guò)選擇性培養(yǎng)基PCAT共獲得776株疑似Bcc菌株,對(duì)這些菌疑似Bee菌株作了recA基因的PCR特異性擴(kuò)增,共確定309株Bcc菌,其中265株、42株、2株分別來(lái)源于西湖水、醫(yī)院和杏果。采用限制性內(nèi)切酶HaeⅢ對(duì)這309株Bcc菌的recA基因片段進(jìn)行了限制性酶切(RFLP)分析。結(jié)果表明,在西湖水的265株Bee菌中,發(fā)現(xiàn)7種不同的限制性酶切圖譜(F,G,I,H,J,B,A):在醫(yī)院來(lái)源的42株Bcc菌中,發(fā)現(xiàn)了

4、3種不同的限制性酶切圖譜(K,G,H);杏果腐Bee菌的限制性酶切圖譜為H,這是國(guó)內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)Bcc菌可引起杏果病害。這表明在這些環(huán)境中,Bee菌群存在明顯的遺傳多態(tài)性。
　　 (2)采用recA.HaelII限制性酶切分析、基因型特異性引物擴(kuò)增、recA基因的序列分析和多位點(diǎn)序列分型(MLST)技術(shù),對(duì)309株來(lái)源于西湖水、醫(yī)院和杏的Bcc菌進(jìn)行了種群分析。首次明確了在西湖水中存在B.multivorans,B.Cenocep

5、acia,B.stabilis,B.vietnamiensis和B.seminalis5個(gè)Bcc種,其中以B.Cenocepacia的菌株數(shù)量最多,占分離自西湖水的Bcc總量的51％。在醫(yī)院環(huán)境中存在B.cepacia,B.cenocepacia和Burkholderia contaminans3個(gè)種,其中也以B.cenocepacia的菌株數(shù)量最多,占分離自醫(yī)院環(huán)境的Bcc總量的73.8％。而引起杏果腐的病原細(xì)菌鑒定為Bee中的B.s

6、eminalis,這是丑seminalis首次作為植物病原菌被發(fā)現(xiàn)。MLST技術(shù)研究表明,該技術(shù)不僅可以區(qū)分Bcc的種,還可以區(qū)分種內(nèi)菌株間的差異。
　　 (3)對(duì)分離自西湖水、醫(yī)院和果腐杏的93株Bee代表菌株進(jìn)行了致病性及其毒力基因BCESM的檢測(cè)和菌株蛋白酶活性研究。在測(cè)試的93個(gè)菌株中,只有17株對(duì)洋蔥不致病,其余76株均能引起洋蔥鱗莖不同程度的腐爛,說(shuō)明這些菌株是洋蔥的致病菌;在測(cè)試的7個(gè)Bcc種中,B.multivo

7、rans和B.vietnamiensis菌株沒(méi)有產(chǎn)蛋白酶活性,其余種的大部分菌株均有產(chǎn)蛋白酶活性,說(shuō)明西湖水中和果腐杏上的Bcc菌同樣具有與對(duì)人體致病相關(guān)的毒力因子,與醫(yī)院致病菌沒(méi)有差異。在苜蓿模型上,來(lái)源于醫(yī)院的B.cepacia,B.cenocepacia和B.contaminans菌株均能導(dǎo)致苜蓿幼苗發(fā)病,來(lái)源于西湖水的B.cenocepacia也能導(dǎo)致苜蓿幼苗發(fā)病,與醫(yī)院臨床致病菌表現(xiàn)出相似的癥狀,這表明來(lái)源于西湖水的這些Bcc