貂源肺炎克雷伯氏菌血清型和毒力基因的檢測(cè)及其致病性研究.pdf

1、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella Pneumoniae，K. Pneumoniae)，是一種可引起多種動(dòng)物患病的條件性致病菌，也是常見(jiàn)的人獸共患病病原。本研究對(duì)貂源肺炎克雷伯氏菌血清型和毒力基因進(jìn)行了檢測(cè)并對(duì)其致病性進(jìn)行了研究；其對(duì)水貂克雷伯氏菌的防控具有重要的實(shí)踐意義，更具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。
　　1．血清型的檢測(cè)
　　采用克雷伯氏菌血清型檢測(cè)PCR方法對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離保存的23株水貂肺炎克雷伯氏菌進(jìn)行了常見(jiàn)血清型（

2、K1、K2、K5、K20、K54和K57）的檢測(cè)。并對(duì)其中15株菌(K.pneumoniae-SD-1~K.pneumoniae-SD-13，K.pneumoniae-SD-15和K.pneumoniae-SD-21）的陽(yáng)性血清型進(jìn)行了克隆測(cè)序分析，且于GenBank中收錄的肺炎克雷伯氏菌菌株作為參考菌株進(jìn)行比較，制作了系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)和同源性的分析。其結(jié)果除了K. pneumoniae-SD-15不是上面血清型中的任何一個(gè)血清型之外，其他2

3、2株都是K2血清型；15株代表菌株中的14株陽(yáng)性血清型K2基因與參考菌株23（分離于人的器官）、wzy-K2（分離于人的痰液）都在一個(gè)分支上，親緣關(guān)系很近；與參考菌株23、HK787、ATCC43816和VGH52523的同源性為99.7％-100%。表明山東地區(qū)以K2血清型為主的強(qiáng)毒株肺炎克雷伯氏菌能感染水貂并且在水貂上流行。
　　2.毒力基因的檢測(cè)
　　采用PCR方法對(duì)主要毒力基因rmpA、菌素、iroNB、iucB、w

4、caG、uge、magA、wabG、allS、ureA、fim和ybtA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示ureA基因的檢出率100%（23/23）；菌素、rmpA、uge和wabG的檢出率均為96%（22/23）；毒力基因IucB檢出率87%（20/23）、毒力基因ybt的檢出率為13%（3/23），其他毒力基因fim、wcaG、allS、magA和iroNB均未檢出，其中有16株菌株均有ureA、IucB、rmpA、菌素、uge和wab6種主要毒力

5、基因，1株菌株均有ureA、IucB、rmpA、菌素、uge、wab和ybtA7種毒力基因。這表明同一菌株有好幾種不同的毒力基因。
　　并對(duì)其中15株菌（K.pneumoniae-SD-1~K.pneumoniae-SD-13，K.pneumoniae-SD-15和K.pneumoniae-SD-21）的陽(yáng)性毒力基因進(jìn)行了克隆測(cè)序分析，且于GenBank中收錄的肺炎克雷伯氏菌菌株作為參考菌株進(jìn)行比較，制作了系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)和同源性的分析

6、。系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)結(jié)果顯示：15株代表菌株中的14株陽(yáng)性rmpA基因與參考菌株TMV-5（分離于人的器官）的血緣關(guān)系很近；15株代表菌株中的14株陽(yáng)性菌素基因與參考菌株CG43（分離于人的血液）、ED23(分離于人的血液)都在一個(gè)分支上；15株代表菌株的陽(yáng)性wabG基因與參考菌株CG43（分離于人的血液）、NTUH-K2044(分離于人的肝臟和血液)都在一個(gè)分支上；15株代表菌株中的12株陽(yáng)性IucB基因與參考菌株RJF999（分離于人的血液

7、）、T69（分離于人的痰液）親緣關(guān)系很近；15株代表菌株中的2株陽(yáng)性ybtA基因與參考菌株NTUH-K2044(分離于人的肝臟和血液)親緣關(guān)系很近。同源性分析結(jié)果顯示：15株代表菌株中的14株陽(yáng)性rmpA基因與參考菌株NTUH-K2044、KCTC2242、ED23和RJF293的同源性為99.1%-100%；15株代表菌株中的14株陽(yáng)性菌素基因與參考菌株ATCC43816、CG43和ED23的同源性為98.2%-100%；15株代表菌

8、株的陽(yáng)性wabG基因與參考菌株NTUH-K2044、KCTC2242、ED23、CAV1217和 CAV1042的同源性為98.4%-100%；15株代表菌株的陽(yáng)性u(píng)reA基因與參考菌株CG43、RJF293、CAV1042和U41的同源性為98.2%-100%；15株代表菌株中的14株陽(yáng)性u(píng)ge基因與參考菌株KCTC2242、RJF293、CAV1453和 KP52.145的同源性為97.8%-100%；15株代表菌株中的12株陽(yáng)性I

9、ucB基因與參考菌株RJF293和 sb227的同源性為94.6-99.7%；15株代表菌株中的2株代表菌株的ybtA基因與參考菌株NTUH-K2044、KP36、11和ED23的同源性99.3-99.7%。結(jié)果表明貂源肺炎克雷伯氏菌與人源肺炎克雷伯氏菌的親緣關(guān)系很近。
　　3.致病性研究
　　本研究根據(jù)分離菌株所攜帶的血清型、毒力基因的不同選擇3株菌株，建立貂源肺炎克雷伯氏菌對(duì)小鼠和水貂的致病性研究。分別給小鼠和水貂攻毒后

10、，結(jié)果顯示，在2—8天均表現(xiàn)精神沉郁、食欲減退，結(jié)膜蒼白，呼吸淺速，站立不穩(wěn)且抽搐，被毛逆亂，體溫升高，偶爾咳嗽，鼻腔內(nèi)有分泌物，第4—7天死亡達(dá)到高峰，剖檢死亡小鼠和水貂發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)均有明顯的黏液，且易拉絲，肝有壞死灶、發(fā)硬、發(fā)黑；肺腫大出血；病理組織學(xué)觀(guān)察，肺、肝，腦都有不同程度的出血，充血現(xiàn)象。LD50結(jié)果顯示， K. pneumoniae-SD-12和K. pneumoniae-SD-21菌株對(duì)小鼠的LD50分別為5.0×102C

11、FU和3.2×100CFU；對(duì)水貂的 LD50分別為1.6×103CFU和3.2×101CFU；然而 K. pneumoniae-SD-15對(duì)小鼠和水貂都沒(méi)有致病性。由上述血清型和毒力基因檢測(cè)可知，K. pneumoniae-SD-12和K. pneumoniae-SD-21菌株均有莢膜血清型K2、菌素和rmpA毒力基因，而K. pneumoniae-SD-15不是血清型K2，且沒(méi)有菌素和rmpA毒力基因。本研究的結(jié)果證實(shí)，貂源肺炎克雷