貂源肺炎克雷伯氏菌血清型和毒力基因的檢測及其致病性研究.pdf

1、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella Pneumoniae，K. Pneumoniae)，是一種可引起多種動物患病的條件性致病菌，也是常見的人獸共患病病原。本研究對貂源肺炎克雷伯氏菌血清型和毒力基因進行了檢測并對其致病性進行了研究；其對水貂克雷伯氏菌的防控具有重要的實踐意義，更具有重要的公共衛(wèi)生學意義。
　　1．血清型的檢測
　　采用克雷伯氏菌血清型檢測PCR方法對本實驗室分離保存的23株水貂肺炎克雷伯氏菌進行了常見血清型（

2、K1、K2、K5、K20、K54和K57）的檢測。并對其中15株菌(K.pneumoniae-SD-1~K.pneumoniae-SD-13，K.pneumoniae-SD-15和K.pneumoniae-SD-21）的陽性血清型進行了克隆測序分析，且于GenBank中收錄的肺炎克雷伯氏菌菌株作為參考菌株進行比較，制作了系統發(fā)生樹和同源性的分析。其結果除了K. pneumoniae-SD-15不是上面血清型中的任何一個血清型之外，其他2

3、2株都是K2血清型；15株代表菌株中的14株陽性血清型K2基因與參考菌株23（分離于人的器官）、wzy-K2（分離于人的痰液）都在一個分支上，親緣關系很近；與參考菌株23、HK787、ATCC43816和VGH52523的同源性為99.7％-100%。表明山東地區(qū)以K2血清型為主的強毒株肺炎克雷伯氏菌能感染水貂并且在水貂上流行。
　　2.毒力基因的檢測
　　采用PCR方法對主要毒力基因rmpA、菌素、iroNB、iucB、w

4、caG、uge、magA、wabG、allS、ureA、fim和ybtA進行檢測，結果顯示ureA基因的檢出率100%（23/23）；菌素、rmpA、uge和wabG的檢出率均為96%（22/23）；毒力基因IucB檢出率87%（20/23）、毒力基因ybt的檢出率為13%（3/23），其他毒力基因fim、wcaG、allS、magA和iroNB均未檢出，其中有16株菌株均有ureA、IucB、rmpA、菌素、uge和wab6種主要毒力

5、基因，1株菌株均有ureA、IucB、rmpA、菌素、uge、wab和ybtA7種毒力基因。這表明同一菌株有好幾種不同的毒力基因。
　　并對其中15株菌（K.pneumoniae-SD-1~K.pneumoniae-SD-13，K.pneumoniae-SD-15和K.pneumoniae-SD-21）的陽性毒力基因進行了克隆測序分析，且于GenBank中收錄的肺炎克雷伯氏菌菌株作為參考菌株進行比較，制作了系統發(fā)生樹和同源性的分析

6、。系統發(fā)生樹結果顯示：15株代表菌株中的14株陽性rmpA基因與參考菌株TMV-5（分離于人的器官）的血緣關系很近；15株代表菌株中的14株陽性菌素基因與參考菌株CG43（分離于人的血液）、ED23(分離于人的血液)都在一個分支上；15株代表菌株的陽性wabG基因與參考菌株CG43（分離于人的血液）、NTUH-K2044(分離于人的肝臟和血液)都在一個分支上；15株代表菌株中的12株陽性IucB基因與參考菌株RJF999（分離于人的血液

7、）、T69（分離于人的痰液）親緣關系很近；15株代表菌株中的2株陽性ybtA基因與參考菌株NTUH-K2044(分離于人的肝臟和血液)親緣關系很近。同源性分析結果顯示：15株代表菌株中的14株陽性rmpA基因與參考菌株NTUH-K2044、KCTC2242、ED23和RJF293的同源性為99.1%-100%；15株代表菌株中的14株陽性菌素基因與參考菌株ATCC43816、CG43和ED23的同源性為98.2%-100%；15株代表菌

8、株的陽性wabG基因與參考菌株NTUH-K2044、KCTC2242、ED23、CAV1217和 CAV1042的同源性為98.4%-100%；15株代表菌株的陽性ureA基因與參考菌株CG43、RJF293、CAV1042和U41的同源性為98.2%-100%；15株代表菌株中的14株陽性uge基因與參考菌株KCTC2242、RJF293、CAV1453和 KP52.145的同源性為97.8%-100%；15株代表菌株中的12株陽性I

9、ucB基因與參考菌株RJF293和 sb227的同源性為94.6-99.7%；15株代表菌株中的2株代表菌株的ybtA基因與參考菌株NTUH-K2044、KP36、11和ED23的同源性99.3-99.7%。結果表明貂源肺炎克雷伯氏菌與人源肺炎克雷伯氏菌的親緣關系很近。
　　3.致病性研究
　　本研究根據分離菌株所攜帶的血清型、毒力基因的不同選擇3株菌株，建立貂源肺炎克雷伯氏菌對小鼠和水貂的致病性研究。分別給小鼠和水貂攻毒后

10、，結果顯示，在2—8天均表現精神沉郁、食欲減退，結膜蒼白，呼吸淺速，站立不穩(wěn)且抽搐，被毛逆亂，體溫升高，偶爾咳嗽，鼻腔內有分泌物，第4—7天死亡達到高峰，剖檢死亡小鼠和水貂發(fā)現腹腔內均有明顯的黏液，且易拉絲，肝有壞死灶、發(fā)硬、發(fā)黑；肺腫大出血；病理組織學觀察，肺、肝，腦都有不同程度的出血，充血現象。LD50結果顯示， K. pneumoniae-SD-12和K. pneumoniae-SD-21菌株對小鼠的LD50分別為5.0×102C

11、FU和3.2×100CFU；對水貂的 LD50分別為1.6×103CFU和3.2×101CFU；然而 K. pneumoniae-SD-15對小鼠和水貂都沒有致病性。由上述血清型和毒力基因檢測可知，K. pneumoniae-SD-12和K. pneumoniae-SD-21菌株均有莢膜血清型K2、菌素和rmpA毒力基因，而K. pneumoniae-SD-15不是血清型K2，且沒有菌素和rmpA毒力基因。本研究的結果證實，貂源肺炎克雷