牛源金黃色葡萄球菌生物被膜相關(guān)基因分析及抗生素對(duì)其影響.pdf

1、金黃色葡萄球菌是奶牛乳腺炎的主要致病菌，在乳腺中主要以生物被膜的形式存在。研究金黃色葡萄球菌生物被膜的形成能力和相關(guān)效應(yīng)因子，對(duì)于我們?cè)谂R床治療中篩選針對(duì)生物被膜的藥物和研究抑制生物被膜形成的抗原表位疫苗具有十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜進(jìn)行如下研究:
　　1.奶牛乳腺炎葡萄球菌生物被膜形成及相關(guān)基因分析
　　利用硅膠片法培養(yǎng)葡萄球菌生物被膜，經(jīng)充分洗滌后對(duì)生物被膜進(jìn)行銀染定性判斷菌株形成生物被膜的能力，通

2、過生物被膜菌落結(jié)晶紫染色法定量檢測(cè)菌株生物被膜的形成能力，并用掃描電鏡觀察被膜結(jié)構(gòu)。銀染法定性結(jié)果顯示137株葡萄球菌中有120株形成肉眼可見的生物被膜，生物被膜形成率為87.6％；結(jié)晶紫染色定量檢測(cè)與硅膠粘附的有132株，不粘附的有5株。對(duì)葡萄球菌bap、icaAD、icaBC、sar、agr、sigB、clfaA、clfaB、fnbpA和fnbpB基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)所用的137株葡萄球菌中，57株能擴(kuò)增出bap基因；有43

3、株和54株分別能擴(kuò)增出icaAD和icaBC；有73株、49株和38株分別擴(kuò)增出sigB、sar和agr；分別有76株和50株染色體中存在clfaA和clfaB；fnbpA和fnbpB分別在52株和26株菌株中擴(kuò)增出。推測(cè)bap、sigB、sar、icaAD和icaBC基因是生物被膜形成的重要相關(guān)基因；agr及粘附素基因clfaA、clfaB、fnbpA和fnbpB對(duì)生物被膜形成的作用不明顯。
　　2.抗生素對(duì)生物被膜的影響

4、>　　采用硅膠片24孔板法培養(yǎng)e9和e25株生物被膜，初始培養(yǎng)時(shí)每孔分別加入1ml含有1/16MIC抗生素的TSB，每12小時(shí)用含抗生素的TSB換液，37℃連續(xù)培養(yǎng)3天，采用結(jié)晶紫染色，測(cè)定492nm處的光密度值。發(fā)現(xiàn)對(duì)于生物被膜強(qiáng)株e9，頭孢吡肟有明顯的抑制作用，Amp、Met對(duì)生物被膜的形成沒有抑制作用，生物被膜的形成反而增強(qiáng)；而對(duì)于生物弱株e25，Amp和頭孢吡肟對(duì)其生物被膜的形成幾乎沒有抑制作用，Met有抑制作用，與空白對(duì)照組相

5、比差異極顯著。
　　分別取實(shí)驗(yàn)菌株培養(yǎng)3天和7天的生物被膜，放入含各種抗生素的TSB的24孔板37℃培養(yǎng)1天，每12小時(shí)用含抗生素的TSB換液，結(jié)晶紫染色后測(cè)492nm的OD值。對(duì)于生物被膜強(qiáng)株e9，除了低濃度(1/16MIC)的頭孢吡肟，其他濃度的抗生素都對(duì)其3天生物被膜有抑制作用，10倍MIC的Amp和頭孢吡肟抑制效果顯著(P＜0.05)。除了MIC濃度的Amp，其他濃度的抗生素都對(duì)7天成熟生物被膜有抑制作用，抗生素濃度越大作

6、用越明顯。對(duì)于生物被膜弱株e25，1/16MIC的Amp對(duì)3天生物被膜幾乎沒有抑制作用，其他濃度的抗生素都有抑制作用，但不顯著。而MIC的Amp對(duì)7天生物被膜有很微弱的抑制作用，10倍和20倍MIC抗生素濃度有抑制作用；三種濃度的Met和頭孢吡肟對(duì)7天生物被膜都有抑制作用，20倍MIC的Met和頭孢吡肟與對(duì)照組相比差異極顯著(P＜0.01)。結(jié)果表明:高濃度比低濃度的Amp、Met、頭孢吡肟對(duì)生物被膜有較好的抑制作用，相同濃度的抗生素對(duì)

7、未成熟生物被膜有較好的抑制作用。低濃度的Amp、Met對(duì)生物被膜幾乎沒有抑制作用，反而有利于刺激促進(jìn)生物被膜的形成，生物被膜形成能力越強(qiáng)的菌株，這種促進(jìn)作用越明顯。
　　3.構(gòu)建奶牛乳腺T7噬菌體展示cDNA文庫
　　使用Straight A’sTM mRNA Isolation System的Magnetight Oligo(dT) Particles分離純化奶牛乳腺mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。雙鏈cDNA經(jīng)過末端修