豬瘟抗體阻斷ELISA檢測方法的建立和對豬瘟活疫苗免疫效果的評價.pdf

1、本研究將含有編碼豬瘟病毒囊膜糖蛋白E2基因的重組桿狀病毒接種于SF9昆蟲細胞中，經(jīng)復壯和懸浮培養(yǎng)后收集細胞上清，過濾后用鎳柱做親和層析純化E2蛋白，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，在約53Kda處有一特異表達的蛋白帶，同豬瘟病毒E2蛋白的大小基本一致；Western-blot印跡表明，該蛋白帶能與豬瘟陽性血清發(fā)生特異反應。將豬瘟單克隆抗體WH303株的雜交瘤細胞從液氮中取出復蘇，培養(yǎng)增殖后接種于BALB/C小鼠腹腔，5天后收獲含有單抗的腹水，并

2、測定其效價。腹水處理后用ProteinG親和層析純化單克隆抗體，經(jīng)SDS-PAGE鑒定后用過碘酸鈉法進行標記，測定酶標抗體的濃度，并于-20℃凍存。
　　 以純化的E2蛋白和制備的酶標單抗為基礎，建立了豬瘟抗體阻斷ELISA檢測方法。通過對ELISA各反應條件的優(yōu)化，確定了最佳反應條件：E2蛋白的最佳包被濃度為0.09μg/rnl，最適包被條件為4℃16h;最佳封閉液為PBST+10％脫脂奶粉+Proclin300+5％海藻糖，

3、封閉條件為4℃16h;最佳血清稀釋液為PBST+5％奶粉，稀釋倍數(shù)為2倍，血清孵育時間為37℃1h;酶標單抗的最佳工作濃度為0.37μg/ml，最佳酶標單抗稀釋液為Peroxidase Conjugate Stabilizer，工作條件為25℃30min。采用優(yōu)化好的ELISA反應條件，檢測了豬瘟抗體血清盤，將OD值用ROC曲線法進行分析，得到本方法的陰陽血清判定值為：36％的抗體阻斷率，檢測灰區(qū)介于32％-40％的抗體阻斷率之間。對建

4、立的豬瘟抗體阻斷ELISA法進行了性能評估，結果表明：本方法和常見的豬病毒抗體沒有交叉反應；與IDEXX試劑盒相比較，其特異性和敏感性分別為：94.2％和98％;用本方法檢測“歐盟實驗室質控品”，結果同IDEXX豬瘟抗體試劑盒的檢測結果一致；用免疫豬的血清評估本方法，顯示本方法和IDEXX試劑盒的相關性高于0.8。
　　 根據(jù)本方法的檢測結果，對豬瘟弱毒疫苗的免疫劑量和免疫保護期進行了研究。用1200RID、6000RID和24