解淀粉芽孢桿菌C06防治桃褐腐病菌的機制及其產(chǎn)生的γ-多聚谷氨酸在定殖中的作用.pdf

1、芽孢桿菌菌株C06具有很強的水果采后保鮮的潛力,通過Bio-log、16S ribosomalRNA和BOX-PCR等方法鑒定該菌株屬于解淀粉芽孢桿菌.C06能夠防治Moniliniafructicola引起的桃褐腐病,將桃子的貨架期從3天延長到7天；用該菌株的發(fā)酵上清液直接處理桃褐腐病菌可以抑制桃褐腐病菌孢子的萌發(fā)和菌絲的生長,表明C06的發(fā)酵上清液中含有抑病桃褐腐病菌的物質(zhì)。另外,解淀粉芽孢桿菌C06還以在平板上形成粘性的菌落并向培

2、養(yǎng)基中分泌粘性物質(zhì)。本研究主要分為三個方面:1,鑒定C06上清液中的抑菌物質(zhì)；2,鑒定C06向細胞外分泌的粘性物質(zhì)及其在定殖中的作用；3,篩選高產(chǎn)胞外粘質(zhì)的突變體并分析高產(chǎn)的機理。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.以解淀粉芽孢桿菌C06的酶切基因組為檢測子,以枯草芽孢桿菌168的酶切基因組為驅(qū)動子,進行差減雜交(subtractive suppressed hybridization,SSH),克隆C06中的特異基因.本研究共得到4

3、3段特異的DNA序列,其中有三個DNA片段分別與脂肽類化合物bacilloymcin D和fengycin的合成酶基因具有很高的同源性.本研究采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析技術(shù)檢測解淀粉芽孢桿菌C06發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì),發(fā)現(xiàn)野生型的C06能夠產(chǎn)生兩種脂肽類化合物bacilloymcin D和fengycin.根據(jù)SSH得到的bmyC和fenD片段,構(gòu)建突變體C06△bmyC和C06△fenD,根據(jù)F

4、ZB42中的sfp的基因序列構(gòu)建突變體C06△sfp sfp基因編碼4'-磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(4’-phosphopantetheinyl transferase),是非核糖體途徑合成脂肽類化合物的關(guān)鍵基因.用質(zhì)譜技術(shù)檢測C06△sfp、C06△bmyC和C06△fenD的發(fā)酵上清液,結(jié)果顯示,C06△sfp不產(chǎn)生任何的脂肽類化合物；C06△bmyC和C06△fenD分別喪失合成bacillomycin D和fengycin的能力

5、.分別用C06、C06△bmyC、C06△fenD和C06△sfp的發(fā)酵上清液處理桃褐腐病菌的孢子和菌絲,結(jié)果顯示,C06△sfp喪失抑制孢子萌發(fā)和菌絲生長的能力,表明脂肽類化合物是C06主要的抑菌物質(zhì)；C06△bmyC具有與野生型C06相似的抑制菌生長的能力,而C06△fenD抑制菌絲生長的明顯弱于C06△bmyC,表明fengycin是C06主要的抑制菌絲生長的次生代謝物；C06△bmyC和C06△fenD都能很好的抑制桃褐腐病菌的

6、孢子萌發(fā),表明在C06抑制孢子萌發(fā)的過程中fenycin和bacillomycin D都很重要。
　　 2.解淀粉芽孢桿菌C06具有向胞外分泌粘性物質(zhì)的能力。本研究通過構(gòu)建解淀粉芽孢桿菌C06的突變體文庫,篩選到四個不產(chǎn)粘質(zhì)的突變體M105、M106、M107和M108。Southern blot結(jié)果顯示,M105是多拷貝插入的轉(zhuǎn)座突變體,M106、M107和M108是單拷貝插入的突變體。用M106、M107和M108進行反向P

7、CR分析,結(jié)果顯示在M106和M107中,轉(zhuǎn)座子插入位點都是ywsC;在M108中,轉(zhuǎn)座子插入為位點是comA。ywsC編碼γ-多聚谷氨酸(γ-PGA)合成酶；comA是調(diào)控基因,可以正向調(diào)控ywsC的合成。進一步用薄層層析、液相色譜和紫外掃描三種方法分析粘性物質(zhì)的性質(zhì),結(jié)果顯示粘質(zhì)的分子量在300-3000kDa,粘質(zhì)的水解產(chǎn)物是谷氨酸、且在260nm和280nm處沒有特異性的吸收峰,證明該物質(zhì)是由谷氨酸通過非肽鍵連接而成的多聚物——

8、γ-PGA。本研究通過比較野生型的C06與不產(chǎn)γ-PGA的突變體M106和C06△ywsC,發(fā)現(xiàn)野生型C06在生物膜形成能力、群集運動能力和表面吸附能力三個方面都強于突變體,這可能是因為γ-PGA具有很強的粘性、可以吸附大量的陽離子,增強菌體之間的聚集能力和菌體與基質(zhì)表面的吸附能力。生防細菌在植物根部和果實表面的定殖通常經(jīng)過三個步驟:(1),以游動態(tài)細胞的形式吸附在植物的表面；(2),形成微菌落；(3),通過群集運動擴展菌落。由此推測,

9、γ-PGA可以促進生防菌在活體上的定殖能力,實驗結(jié)果顯示野生型的C06-MA在蘋果表面的定殖能力明顯強于C06△ywsC。本研究還重點研究了EPS(胞外多糖)、TasA(胞外蛋白)和γ-PGA與生物膜形成的關(guān)系。結(jié)果顯示,在僅產(chǎn)生γ-PGA的條件下,芽孢桿菌無法形成具有復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)的菌落；而在γ-PGA與胞外多糖或TasA蛋白共同作用下,芽孢桿菌可以形成菌落,但是其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜度低于三者共同作用的結(jié)果。
　　 3.在篩選突變體文庫

10、的過程中,我們還得到一株生物膜形成缺陷突變體M306。色譜檢測結(jié)果顯示,M306的γ-PGA的產(chǎn)量是野生型的兩倍。Southern blot和反向PCR的結(jié)果顯示,TnYLB-1轉(zhuǎn)座子在M306中是單拷貝的,且插入位點在RBAM_034450和phrF之間.Quantative RT-PCR(qRT-PCR)分析結(jié)果顯示,與野生型的C06相比,M306中phrF的表達水平?jīng)]有明顯變化,而RBAM034450的表達水平下降明顯,證明M30

11、6的突變表型是由RBAM034450的突變引起的.RBAM_034450是轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白,可以受到逆境環(huán)境的誘導(dǎo),調(diào)控下游基因的表達.定點突變 RBAM_034450,構(gòu)建突變體 C06ARBAM.用qRT-PCR分析C06△RBAM和M306相關(guān)基因的表達,結(jié)果顯示與野生型C06相比,C06△RBAM和M306的生物膜形成關(guān)鍵基因epsD(胞外多糖合成酶基因)和yqxM(TasA合成分泌基因)的表達水平明顯下降,而ywtB(γ-PGA合

12、成酶基因)的表達沒有明顯變化.構(gòu)建C06的胞外多糖合成突變體C06△espA和TasA蛋白合成突變體C06△tasA,檢測突變體γ-PGA的產(chǎn)量,發(fā)現(xiàn)C06△espA的產(chǎn)量與M306相近,明顯高于野生型；而C06△tasA的產(chǎn)量與野生型沒有明顯差別,證明在突變體M306中γ-PGA的高產(chǎn)是由于胞外多糖合成酶基因下調(diào)表達間接導(dǎo)致.胞外多糖的合成與γ-PGA的合成都可以利用三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物為底物；當(dāng)胞外多糖的合成途徑被破壞后,可以增加γ