花生二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(DGAT)基因的克隆與分析.pdf

1、三酰甘油(TAG)是油料作物最主要的儲存脂類，二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶是TAG合成途徑的限速酶，其主要作用是催化二酰甘油加上酰基脂肪酸形成三酰甘油。到目前為止，在植物中發(fā)現(xiàn)了3種不同類型的DGAT蛋白，其中DGAT1和DGAT2蛋白已在擬南芥、油菜等多種植物中發(fā)現(xiàn)，第三種DGAT蛋白僅在花生中發(fā)現(xiàn)。三種不同類型的DGAT蛋白序列相似性比較低，但是均含有一個酰基轉(zhuǎn)移酶保守結(jié)構(gòu)域，而同一類型的DGAT蛋白C端高度保守。研究表明，植物DGAT主要與

2、種子發(fā)育、種子萌發(fā)、幼苗發(fā)育、葉片新陳代謝等過程相關(guān)。
　　由于花生DGAT1(AhDGAT1)基因和DGAT2(AhDGAT2)基因序列未知，我們根據(jù)大豆GmDGAT1基因和苜蓿MsDGAT2基因序列，利用同源克隆和RACE(Rapid-Amplification of cDNA Ends)的方法來擴(kuò)增AhDGAT1和AhDGAT2的cDNA序列。最終我們得到了1480bp的AhDGAT1基因部分序列和1222bp的AhDGAT

3、2基因序列。通過與其他DGAT蛋白序列比對，AhDGAT1基因部分序列編碼的蛋白聚類到DGAT1家族。而AhDGAT2基因編碼的蛋白聚類到DGAT2家族。
　　在魯花14中，我們克隆得到了兩種類型的AhDGAT2基因，分別命名為AhDGAT2a和AhDGAT2b。序列分析表明，兩者均包含1005bp的編碼區(qū)和192bp的3’ UTR(Untranslated Region)，在編碼區(qū)，核苷酸序列有12個堿基的差異。AhDGAT2a

4、編碼334個氨基酸，蛋白分子量為37。502 kD，等電點為9.47，AhDGAT2b編碼334個氨基酸，但是在N端和AhDGAT2a蛋白具有3個氨基酸的差異，其蛋白分子量為37。540 kD，等電點為9.53.AhDGAT2a和AhDGAT2b蛋白含有酰基轉(zhuǎn)移酶保守結(jié)構(gòu)域，屬于酰基轉(zhuǎn)移酶家族。通過TMHMM2.0軟件分析，發(fā)現(xiàn)AhDGAT2蛋白在N端具有兩個跨膜結(jié)構(gòu)域。而且在不同花生品種中，AhDGAT2蛋白的氨基酸序列存在多態(tài)性。<

5、br>　　用半定量RT-PCR方法分析AhDGAT1和AhDGAT2基因在各器官的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)前者在花中表達(dá)量較高，而后者在葉和花中表達(dá)量都較高，說明相對于AhDGAT1，AhDGAT2可能在葉片TAG合成過程具有更重要的作用。在種子發(fā)育過程中，AhDGAT1和AhDGAT2基因均在種子發(fā)育前期的表達(dá)量較高，其中AhDGAT1基因在第2-4個時期表達(dá)量顯著比其它時期高，而且在第3個時期達(dá)到最高峰；而AhDGAT2基因則在第2個時期表達(dá)

6、量較高，這些結(jié)果表明這兩種花生DGAT基因可能在不同種子發(fā)育階段起不同作用。
　　為了進(jìn)一步研究魯花14中兩種AhDGAT2蛋白的具體功能，我們分別構(gòu)建了組成性過量表達(dá)載體、組成性反義表達(dá)載體、種子特異性過量表達(dá)載體和種子特異性反義表達(dá)載體四種載體。其中組成性過量表達(dá)載體pROK II-35S-AhDGAT2a和pROK II-35S-AhDGAT2b已經(jīng)轉(zhuǎn)化了擬南芥、煙草和花生。得到AhDGAT2a轉(zhuǎn)基因煙草18株，轉(zhuǎn)基因花生7

7、株，AhDGAT2b轉(zhuǎn)基因煙草8株，轉(zhuǎn)基因花生1株。用氣相色譜法檢測部分轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片脂肪酸含量，結(jié)果顯示，AhDGAT2a和AhDGAT2b轉(zhuǎn)基因植株葉片中的脂肪酸總含量比野生型煙草提高5。37％-22.82％，并且主要是提高了不飽和脂肪酸(C16:1、C18:1n9、C18:3n3、C20:1、C22:5n3)的含量，而飽和脂肪酸含量(C16:0，C18:0，C20:0，C24:0)則無明顯改變。說明AhDGAT2對提高煙草轉(zhuǎn)基