二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶DGAT的生物信息學(xué)分析及馬鈴薯致病疫霉中六個(gè)DGAT基因的功能鑒定.pdf

1、利用代謝工程技術(shù)在植物中異源合成超長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(Very long-chain polyunsaturated fatty acids，VLCPUFAs)，可為人們提供一條穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)、可持續(xù)的魚油替代生產(chǎn)途徑。目前，產(chǎn)量低是限制以植物為生物反應(yīng)器替代生產(chǎn)VLCPUFAs的主要因素。將?；D(zhuǎn)移酶等輔助因子與合成VLCPUFAs所需酶共轉(zhuǎn)化植物，能有效提高轉(zhuǎn)基因植物VLCPUFAs含量。
　　二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶DGAT(Acyl

2、-CoA:diacylglycerol acyltransferase)是三酰甘油(TAG)甘油磷酸合成途徑的限速酶。研究表明在不同物種和不同組織中，DGAT1和DGAT2催化TAG合成的功能是非冗余的，且對(duì)底物脂肪酸的選擇具有偏好性。提高轉(zhuǎn)基因植物合成的VLCPUFAs整合到TAG中的比率，可提高VLCPUFAs產(chǎn)量，因此催化TAG合成的二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶的底物專一性影響著某種脂肪酸在植物體內(nèi)的合成量。本研究目的是從富含長(zhǎng)鏈多不飽和脂

3、肪酸的馬鈴薯致病疫霉中克隆對(duì)VLCPUFAs具有高活性的DGAT。
　　本研究利用生物信息學(xué)，對(duì)真核生物DGAT進(jìn)行廣泛鑒定，分析了DGAT1和DGAT2的基因結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式的不同，為DGAT功能研究奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，從富含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的馬鈴薯致病疫霉克隆到6個(gè)DGAT基因，并通過在酵母和擬南芥異源表達(dá)進(jìn)行初步功能鑒定，為揭示6個(gè)DGAT在馬鈴薯致病疫霉TAG合成中的作用以及進(jìn)一步篩選鑒定其對(duì)VLCPUFAs的催化活

4、性奠定了基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:
　　(1)通過在高等植物、真菌和動(dòng)物的基因組中進(jìn)行廣泛搜索，共鑒定到171個(gè)DGAT基因，35種高等植物中鑒定到146個(gè)DGAT,包括53個(gè)DGAT1、83個(gè)DGAT2、5個(gè)DGAT3(Cytosolic DGAT)、5個(gè)DGAT4(WS/DGAT);6種真菌中鑒定到2個(gè)DGAT1和11個(gè)DGAT2;6種動(dòng)物中鑒定到DGAT1和DGAT2各6個(gè)。分析結(jié)果表明DGAT1和DGAT2廣泛存在于真核生物中;

5、而DGAT3和DGAT4是十字花科植物所特有的。
　　(2)對(duì)5種模式植物（擬南芥、大豆、水稻、番茄、玉米）和動(dòng)物小鼠的DGAT1和DGAT2的基因結(jié)構(gòu)分析表明，DGAT1和DGAT2基因結(jié)構(gòu)高度保守且差異明顯，DGAT1的外顯子數(shù)目多于DGAT2;跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明DGAT1的跨膜結(jié)構(gòu)域數(shù)目多于DGAT2;基因芯片分析表明，5種植物DGAT基因在不同發(fā)育時(shí)期具有特異性表達(dá)。
　　(3)成功克隆到馬鈴薯致病疫霉6個(gè)DGAT的

6、cDNA全長(zhǎng)片段，生物信息學(xué)分析表明，這6個(gè)DGAT基因均屬于DGAT2，分別命名為PiDGAT2-1/2/3/4/5/6。
　　(4)構(gòu)建PiDGAT的酵母表達(dá)載體，在酵母dgat突變體H1246中異源表達(dá)，6個(gè)轉(zhuǎn)基因酵母都能在含有油酸的培養(yǎng)基中恢復(fù)正常生長(zhǎng)，說明它們都具有DGAT酶活性，能在酵母中催化合成TAG; TAG含量測(cè)定表明，PiDGAT2-4基因在酵母中二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶活性最高。
　　(5)分別利用35S強(qiáng)啟