小白菜硫代葡萄糖苷合成影響因子研究及脂肪族硫苷合成基因CYP79F1的克隆.pdf

1、硫代葡萄糖苷(簡稱硫苷)是一類富含氮、硫的植物次生代謝物質(zhì),主要存在于十字花科植物中,其降解產(chǎn)物與植物風(fēng)味、抗病蟲性以及誘蟲性有關(guān)。隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)硫苷還與人類自身健康有著非常密切的關(guān)系,大量食用蕓薹屬蔬菜能夠降低一些癌癥的發(fā)病率。因此,如何提高十字花科蕓薹屬蔬菜中有益硫苷組分的含量已成為近幾年的研究熱點。本文以原產(chǎn)我國并且在我國長江流域廣泛栽培的小白菜(Brassica campestris L.ssp.chinensis v

2、ar.communis)為試驗材料,研究了硫、糖、鹽等對硫苷含量的影響,及乙烯、脫落酸,細(xì)胞分裂素、生長素等植物生長物質(zhì)對小白菜硫苷合成的調(diào)控,及脂肪族硫苷合成過程中的關(guān)鍵基因CYP79F1的克隆。以期闡明硫、糖、鹽等對小白菜硫苷含量和組成的影響,明確植物生長物質(zhì)對硫苷合成的調(diào)控作用;為保健蔬菜的開發(fā)、培育,通過化學(xué)調(diào)控等方法改善蔬菜中硫苷的含量提供一定理論指導(dǎo)。小白菜CYP79F1基因的克隆為將來利用基因工程手段調(diào)控脂肪族硫苷含量提供

3、了可能。主要研究內(nèi)容及取得的結(jié)果如下:
　　 1.研究了兩個(0.0558和1.0558 mM)供硫水平對兩個品種小白菜‘上海青’和‘油冬兒’的生長和硫苷含量的影響。結(jié)果表明,缺硫明顯抑制了小白菜的生長,同時也減少了兩種小白菜大部分單個硫苷和總硫苷含量。然而,硫供應(yīng)對兩種基因型小白菜的影響有一定的差異。缺硫狀態(tài),對‘上海青’總脂肪族硫苷和總硫苷含量影響較大;但對‘油冬兒’的總吲哚族和芳香族硫苷含量影響較大。
　　 2.以

4、小白菜‘上海青’為試驗材料,研究了不同濃度(0,0.1和0.2M)蔗糖和不同濃度(0,0.1和0.2 M)葡萄糖噴施對小白菜生長和硫苷含量的影響。結(jié)果表明,蔗糖和葡萄糖處理對小白菜的生長無顯著的影響。蔗糖噴施處理顯著增加了小白菜總脂肪族硫苷、總吲哚族硫苷和總硫苷含量。0.2 M葡萄糖噴施處理顯著增加單個硫苷及總硫苷含量,但0.1 M葡萄糖噴施處理對硫苷含量沒有顯著影響。然而,蔗糖和葡萄糖處理對芳香族硫苷含量均無顯著影響。
　　

5、3.以小白菜‘上海青’為試驗材料,研究了不同濃度(0,50和100 mM)NaCl處理對小白菜生長及硫苷含量的影響。結(jié)果表明,隨NaCl脅迫程度的加大,小白菜地上部和地下部鮮重及干重逐漸降低。50 mM NaCl處理顯著提高了小白菜地上部的總脂肪族硫苷、總吲哚族硫苷和總硫苷含量;在100 mM NaCl處理下,總吲哚族硫苷含量顯著增加,但顯著降低了芳香族硫苷含量。然而,NaCl脅迫處理降低了小白菜根部大部分硫苷含量。
　　 4.

6、以小白菜‘上海青’和‘油冬兒’為試驗材料,研究了不同濃度(0,10,50,100和200μg1.1-1)乙烯利處理對植株生長和硫苷含量的影響.結(jié)果表明,乙烯利處理下兩種小白菜鮮重有逐漸降低的趨勢。10μ1.1-1乙烯利處理對‘上海青’總脂肪族硫苷和總硫苷誘導(dǎo)效果較好,而100μ1.1-1乙烯利處理對‘油冬兒’總脂肪族硫苷和總硫苷誘導(dǎo)效果較好。另外,乙烯利處理對‘油冬兒’總吲哚族硫苷含量影響不大,但較高濃度(100和200μ1.1-1)處

7、理顯著增加了‘上海青’總吲哚族硫苷含量。另外,不同濃度乙烯利處理均減少了‘上海青’芳香族硫苷含量,然而均增加了‘油冬兒’的芳香族硫苷含量。
　　 5.以小白菜‘上海青’為試驗材料,研究了不同濃度(0,5,10和20 mg.L-1)脫落酸(ABA)處理對小白菜生長和硫苷含量的影響。結(jié)果表明,ABA處理對小白菜生長并無顯著的影響。與對照相比,5 mg.L-1 ABA處理對大部分脂肪族硫苷和總硫苷含量沒有顯著影響,但隨ABA處理濃度的

8、增加,多數(shù)脂肪族硫苷和總硫苷含量降低。然而,大部分單個吲哚族硫苷和總吲哚族硫苷含量隨ABA濃度增加有先增加后降低趨勢,尤其在10 mg.L-1 ABA處理時總吲哚族硫苷含量達(dá)到最高值。另外,20 mg.L-1ABA處理顯著提高了芳香族硫苷的含量。
　　 6.以小白菜‘上海青’為試驗材料,研究了不同濃度(0,0.2,5和20 mg.L-1)細(xì)胞分裂素(CTK)處理對小白菜生長和硫苷含量影響。結(jié)果表明,隨CTK處理濃度增加,小白菜鮮

9、重有逐漸增加的趨勢。20 mg.L-1 CTK處理時小白菜總脂肪族硫苷和總硫苷含量達(dá)到最大值。較高濃度(5和20 mg.L-1)CTK處理時顯著抑制了1-甲氧基吲哚-3-甲基硫苷和總吲哚族硫苷含量。然而,芳香族硫苷含量隨CTK處理濃度增加呈先增加后降低的趨勢,0.2 mg.L-1 CTK處理時達(dá)到最大值。
　　 7.以小白菜‘上海青’為試驗材料,研究了萘乙酸(NAA)濃度及噴施次數(shù),吲哚乙酸(IAA)濃度對小白菜生長和硫苷含量影

10、響。結(jié)果表明,NAA和IAA處理均顯著增加了小白菜鮮重。單次噴施20 mg.L-1 NAA處理顯著增加脂肪族硫苷、芳香族硫苷和總硫苷含量,大部分吲哚族硫苷含量在50mg.L-1 NAA處理時達(dá)到最大值。而兩次噴施NAA處理時,多數(shù)單個硫苷和總硫苷含量均在NAA濃度為10 mg.L-1時達(dá)到最高。5-20 mg.L-1 IAA處理均顯著提高了大部分脂肪族硫苷和總硫苷含量。大部分吲哚族硫苷含量呈先增加后降低趨勢,5mg.L-1 IAA處理時

11、達(dá)到最大值。不同濃度IAA處理均促進了芳香族硫苷合成。
　　 8.根據(jù)擬南芥、大白菜和甘藍(lán)的CYP79F1基因序列設(shè)計特異性引物,以小白菜‘油冬兒’的cDNA為模板,成功克隆到小白菜CYP79F1的cDNA序列,其編碼區(qū)為1623bp,推導(dǎo)的蛋白質(zhì)含有540個氨基酸,分子量為61.468kDa。目前在Genebank只找到大白菜,甘藍(lán)和擬南芥存在同源基因,與本試驗克隆到的基因相比,相似性分別為99.07％,97.57％和83.3