蘿卜硫苷合成代謝關(guān)鍵基因克隆與表達(dá)特征分析.pdf

1、蘿卜(RaphanussativusL.)是一種重要十字花科蔬菜作物，具有較高的食用和藥用價(jià)值。硫代葡萄糖苷（簡(jiǎn)稱(chēng)硫苷）中的4-甲基亞磺酰丁基硫苷(Glucoraphanin，RAA)的水解產(chǎn)物蘿卜硫素(Sulforaphane，SF)是到目前為止在蔬菜中發(fā)現(xiàn)的抗癌效果最強(qiáng)的活性物質(zhì)之一。硫苷是十字花科蔬菜中的一類(lèi)重要次生代謝產(chǎn)物，硫苷及其降解產(chǎn)物具有抗蟲(chóng)、影響風(fēng)味和抗癌等作用。近年來(lái)隨著對(duì)擬南芥和白菜基因組全序列測(cè)定的完成，人們對(duì)硫苷

2、的生物合成代謝途徑及相關(guān)重要基因有了較為深入的了解，但是目前未見(jiàn)在蘿卜中有關(guān)硫苷合成調(diào)控基因的報(bào)道。本論文克隆了脂肪族硫苷合成代謝過(guò)程中相關(guān)重要基因序列及其啟動(dòng)子序列，并對(duì)其中部分基因在蘿卜中的表達(dá)特性進(jìn)行了初步研究，以期通過(guò)基因改良工程或表達(dá)調(diào)控手段選育高硫苷含量的蘿卜新品種奠定理論基礎(chǔ)。本研究的主要結(jié)果如下:
　　1.利用電子克隆法從十字花科蔬菜蘿卜中分離獲得硫苷合成代謝過(guò)程中RsBCAT4、RsUGT74B1、RsGS-OX

3、1的3個(gè)關(guān)鍵基因序列。將得到基因的開(kāi)放閱讀框序列及推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank中已公布相應(yīng)序列進(jìn)行同源性比較構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。另外利用半定量及熒光定量PCR技術(shù)研究其在不同發(fā)育時(shí)期（不同部位）的表達(dá)情況;此外，利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)不同處理（傷害，MeJA）下的蘿卜葉片進(jìn)行表達(dá)分析。結(jié)果表明RsBCAT4在幼苗期（葉、莖、根）均表達(dá)，在膨大期和成熟期根部基本不表達(dá)，RsUGT74B1在幼苗期、在膨大期和成熟期表達(dá)量均很低，RsGS-

4、OX1在正常情況下表達(dá)量很低，但這三個(gè)基因在WO、MeJA處理后表達(dá)量均明顯增大。
　　2.利用電子克隆法分離獲得RsCYP79F1、RsCYP83A1、RsSUR1和RsSOT18基因的cDNA及DNA序列;同時(shí)應(yīng)用染色體步移法分離獲得這四個(gè)基因的啟動(dòng)子序列。用PLACE、PlantCARE在線預(yù)測(cè)工具分析表明:其序列舍有啟動(dòng)子特定調(diào)控元件（如TATA-box，CAAT-box等），還有一些順式調(diào)控元件（如MYB結(jié)合位點(diǎn)、ABA

5、響應(yīng)元件、GA響應(yīng)元件、MeJA響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件等）和一些其它調(diào)控元件，這說(shuō)明這四個(gè)基因的表達(dá)可能受這些因素的調(diào)控。
　　3.利用電子克隆法分離獲得RsMyr1和RsMyr2基因cDNA及DNA序列;同時(shí)利用染色體步移法分離獲得RsMyr2基因啟動(dòng)子序列。用PLACE、PlantCARE在線預(yù)測(cè)工具分析表明:其序列舍有啟動(dòng)子的特定調(diào)控元件，（如CAAT-box，TATA-box等），還有一些順式調(diào)控元件（如MYB結(jié)合位點(diǎn)、AB

6、A響應(yīng)元件、GA響應(yīng)元件、茉莉酸響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件）和一些其它的調(diào)控元件，說(shuō)明蘿卜RsMyr2基因的表達(dá)可能受這些因素調(diào)控;另外將RsMyr1和RsMyr2基因成熟編碼區(qū)（去除信號(hào)肽）連接到表達(dá)載體pET-30α，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，產(chǎn)生了比預(yù)期大約8％的重組蛋白。最后構(gòu)建了RsMyr2的過(guò)表達(dá)載體。研究結(jié)果為評(píng)價(jià)蘿卜黑芥子酶分子特征和生物學(xué)功能提供了理論基礎(chǔ)。