IBDV-VP2多表位串聯基因的原核表達及表達產物免疫原性分析.pdf

1、傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起雞的急性、高度接觸性傳染病,是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一。該病毒主要侵害雞的中樞免疫器官——法氏囊,從而導致免疫抑制,造成對其他疫病的易感性增強。近年來,IBDV分子生物學研究雖然取得了較大進展,但在分子水平對IBDV的免疫機理、致病機制、病毒分子的結構與功

2、能方面仍有許多問題有待于進一步深入研究。而鑒定IBDV抗原表位則有助于揭示病毒與機體相互作用的本質,從而進一步探索IBDV的致病機制和免疫機理。
　　 抗原表位,又稱抗原決定簇,它是蛋白質抗原性的物質基礎,具有刺激機體產生抗體或致敏淋巴細胞并能夠與之抗體結合或致敏淋巴細胞識別的特性,在蛋白質抗原的結構與功能中扮演著重要的角色?？梢娬_而詳細地繪制抗原表位圖譜對疾病的診斷、設計無毒副作用的多表位疫苗以及免疫治療試劑等具有積極的意義

3、。目前在預防醫(yī)學領域許多關于以表位為基礎的,如表位疫苗和特異性診斷試劑等的研究也就成了熱點。而多表位疫苗因其攜帶更多的中和表位信息,可以提供更多的保護,本課題以其為出發(fā)點,對IBDV多表位疫苗的分子設計及表達產物的人工保護試驗進行了研究,結果證明該多表位疫苗的研究思路不僅可提供vvIBDV新的防制制劑,而且將為分子免疫學以及高效基因工程疫苗的研究奠定基礎。本研究共分兩部分:
　　 一、IBDV多表位串聯基因的原核表達及免疫原性分

4、析
　　 本研究室前期研究利用4株IBDV-VP2單克隆抗體(McAb)從噬菌體隨機肽庫中篩選得到了4個含有不同IBDV-VP2抗原表位的模擬肽序列。在此基礎上,將4個抗原模擬表位用GGGS四肽連接構建多表位串聯基因4epis。將該基因合成、克隆后,構建原核表達質粒pET-4epis,于大腸桿菌E.coli BL21(DE3)pLysS中表達重組多表位蛋白r4EPIS。SDS-PAGE分析表明目的蛋白獲得了表達,并以包涵體形式存

5、在,經包涵體洗滌、蛋白純化,其純度可達90％以上,分子量約30kDa。將純化后的表達產物免疫SPF雞,ELISA分析其抗血清效價在1:10240以上,Western-blot分析表明表達產物r4EPIS能與IBDV單克隆抗體發(fā)生反應,從而證明該多表位基因4epis在原核中得到了表達,且表達產物具有良好的免疫原性。這為研究超強毒IBDV的免疫機理及基因工程亞單位疫苗的研制奠定了基礎。
　　 二、IBDV-VP2多表位蛋白的人工保護

6、試驗
　　 本研究選取7日齡SPF雞160只,隨機分成8組,平均每組20只,按照以下組別進行試驗:對照組、IBDV疫苗組、弗氏佐劑組、表達蛋白4EPIS組、VP2抗原組、4EPIS+弗氏佐劑(1:2)(體積比)組、4EPIS+弗氏佐劑(1:1)組和4EPIS+弗氏佐劑(2:1)組。根據組別分別于14日齡一免、21日齡二免,對照組則用生理鹽水替代。7d后即28日齡時進行IBDV攻毒,分別于攻毒前、攻毒后的第3d、7d、14d的時候

7、采樣(胸腺、法氏囊、脾臟、血清等)。進行免疫器官指數、ANAE+淋巴細胞百分率、血清SOD活性以及抗體效價等的測定。試驗結果表明:用200個ELD50超強毒IBDV攻擊SPF雞,4EPIS+弗氏佐劑(2:1)組攻毒保護率最高,達90％以上。說明目的蛋白r4EPIS聯合免疫佐劑構建的多表位疫苗能夠促進雞體免疫器官的發(fā)育并有效的阻止IBDV對機體的損傷,能夠維持較高的抗體水平、顯著提高ANAE+淋巴細胞百分率和血清SOD活性,從而提高機體的