鴨源致病性大腸桿菌Ⅰ型菌毛pilA基因序列分析與原核表達(dá)產(chǎn)物免疫原性研究.pdf

1、本文根據(jù)GenBank中人源大腸桿菌pilA基因序列，用OLIG06.0設(shè)計(jì)PCR引物，對(duì)甘露糖敏感血凝試驗(yàn)(MSHA)檢測(cè)陽(yáng)性的鴨源致病性大腸桿菌pilA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、序列測(cè)定及生物信息學(xué)分析；并對(duì)pilA基因進(jìn)行原核表達(dá)和免疫原性檢測(cè)，獲得如下結(jié)果： 應(yīng)用MSHA對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定的185株鴨源致病性大腸桿菌進(jìn)行Ⅰ型菌毛檢測(cè)，陽(yáng)性率為65.9％(122/185)；選取25株MSHA陽(yáng)性的菌株，用PCR擴(kuò)增其pilA基因

2、，其中21株為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為84％。 測(cè)定和分析了5株(GH1.2,CY1.3,EM2.5,SL3.2,YL4.3)鴨源致病性大腸桿菌pilA基因表明：鴨源致病性大腸桿菌pilA基因大小為549bp，編碼182aa，各株之間pilA基因核苷酸同源性為92.4％-100.0％，所編碼氨基酸同源性為92.9％-100％；與人源、雞源及豬源大腸桿菌pilA基因之間核苷酸同源性為87.3％-99.8％，氨基酸同源性為87.5％-99.5

3、％。對(duì)不同宿主來(lái)源大腸桿菌pilA基因所編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、抗原性、抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析比較，結(jié)果顯示Ⅰ型菌毛間具有一定的結(jié)構(gòu)相似性，并存在一定的共同抗原位點(diǎn)；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，各菌株間的遺傳相關(guān)性與其宿主來(lái)源及血清型之間沒(méi)有嚴(yán)格的關(guān)系。 對(duì)菌株GH1.2擴(kuò)增的pilA基因進(jìn)行pMD18-T載體克隆，通過(guò)對(duì)pMD18-T-pilA及pET-32a(+)進(jìn)行BamHⅠ、HindⅢ雙酶切、連接，將pilA基因定向插入pET

4、-32a(+)，經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定表明，成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-pilA，并轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌BL21(DE3)，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物以融合表達(dá)的包涵體形式存在，大小為36kD左右。對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳表達(dá)條件為IPTG0.2mmol/L，誘導(dǎo)4h。 表達(dá)產(chǎn)物用SDS-PAGE切膠及利用重組表達(dá)蛋白所帶的6×His標(biāo)簽用鎳柱親和層析兩種方法對(duì)其進(jìn)行純化，均獲得較好的純化效果。純化后產(chǎn)