豬細(xì)小病毒與副豬嗜血桿菌基因芯片同步檢測(cè)技術(shù)的研究.pdf

1、豬細(xì)小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)和副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，Hps)是目前嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的兩種病原，基因芯片檢測(cè)技術(shù)具有高通量性、并行性、自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，本研究擬建立同步檢測(cè)上述兩種病原的基因芯片檢測(cè)技術(shù)，為臨床猜病診斷提供快速、高通量的檢測(cè)技術(shù)。
　　根據(jù)豬細(xì)小病毒VP2蛋白基因序列和副豬嗜血桿菌infB基因序列，利用Primer Premier5.0軟件分別設(shè)計(jì)兩對(duì)不對(duì)稱P

2、CR引物。首先并利用偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型、豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒和豬瘟病毒4種病毒進(jìn)行了PCR的特異性試驗(yàn)，利用豬鏈球菌2型、金色葡萄球菌、傷寒豬沙門氏菌和大腸桿菌4種病菌進(jìn)行了副豬嗜血桿菌PCR的特異性試驗(yàn)，結(jié)果表明，兩對(duì)引物高度特異，只有豬細(xì)小病毒和副豬嗜血桿菌檢測(cè)為陽性，其余病原均為陰性。隨后在PCR擴(kuò)增最佳的條件下進(jìn)行了3次重復(fù)試驗(yàn)，驗(yàn)證兩對(duì)引物的重復(fù)性。
　　在設(shè)計(jì)上述引物的基因序列處設(shè)計(jì)兩條特異探針，對(duì)引物的

3、下游5'端Cy3標(biāo)記，探針5'端進(jìn)行氨基化修飾，引物合成后用TE buffer稀釋成10μM/L，探針稀釋成5μM/L、10μM/L、15μM/L、20μM/L四個(gè)不同的濃度備用。按照預(yù)設(shè)的程序?qū)⒉煌瑵舛鹊奶结樳M(jìn)行點(diǎn)樣，分別制備PPV與Hps基因芯片，以最佳濃度的探針制備PPV與Hps同步檢測(cè)基因芯片，并用裝有固定增效劑的濕盒固定探針;通過不對(duì)稱PCR得到帶熒光的PCR產(chǎn)物，將其變性并分別與基因芯片在不同的條件下雜交;雜交完成后，將芯片

4、在預(yù)熱后的洗滌液1、洗滌液2和洗滌液3中分別洗滌2min;離心干燥后，用基因芯片掃描儀掃描芯片，觀察并保存所獲得的圖片。
　　在雜交過程中，以PPV為例，對(duì)靶探針長(zhǎng)度、雜交濕度和溫度等條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明基因芯片在雜交過程中，增長(zhǎng)靶探針長(zhǎng)度、增加雜交濕度有利于增強(qiáng)雜交信號(hào)，而PPV基因芯片在47℃時(shí)雜交信號(hào)最好，Hps基因芯片在49℃時(shí)雜交信號(hào)最好。在最優(yōu)的雜交條件下制備、雜交PPV與Hps同步檢測(cè)基因芯片，結(jié)果顯示:不同濃度探

5、針下的熒光信號(hào)無明顯差別，雜交1h比雜交2h的雜交信號(hào)強(qiáng)。根據(jù)上述的雜交結(jié)果選用5μM/L濃度的PPV與Hps探針:制備同步檢測(cè)基因芯片。結(jié)果顯示:在48℃雜交1h的情況下，成功地同步檢測(cè)到了PPV與Hps，且熒光信號(hào)清晰。
　　最后，同批次點(diǎn)制的芯片在同樣的條件下雜交3次，不同批次點(diǎn)制的芯片在同樣條件下雜交3次，結(jié)果表明該基因芯片具有良好的重復(fù)性。將固定好的芯片4℃放置2個(gè)月，同樣條件下雜交，掃描結(jié)果顯示，熒光信號(hào)良好，說明該基