豬Coronin 1A基因在副豬嗜血桿菌感染過程中的功能研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌是引起格拉澤氏病的病原體，該病嚴(yán)重地威脅著全世界范圍內(nèi)的豬群，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，臨診上多表現(xiàn)為多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎。眾所周知，副豬嗜血桿菌只有抵抗了宿主肺臟的吞噬作用才能產(chǎn)生系統(tǒng)性疾病，而肺臟的第一個(gè)防御機(jī)制是豬肺泡巨噬細(xì)胞，它在清除風(fēng)媒傳播的病原體和其他環(huán)境微生物中發(fā)揮了重要作用。有趣的是，高毒力副豬嗜血桿菌能夠阻止豬肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬作用，然而低毒力菌株則被豬肺泡巨噬細(xì)胞吞噬并清除。最近有文獻(xiàn)報(bào)道稱副

2、豬嗜血桿菌感染PK-15細(xì)胞能夠激活NF-κB信號(hào)通路，其機(jī)制是促進(jìn)IκB的降解和p65的磷酸化，繼而刺激多種炎性因子的產(chǎn)生介導(dǎo)炎性應(yīng)答。然而，副豬嗜血桿菌感染的致病機(jī)制還不甚清楚。
　　 Coronin1A蛋白是哺乳動(dòng)物coronin蛋白質(zhì)家族的一員，也稱為TACO或p57蛋白，主要表達(dá)于造血組織及細(xì)胞中，主要分布于細(xì)胞胞漿中。Coronin1A被認(rèn)為在T淋巴細(xì)胞活化、遷移、存活和鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮了重要作用。先前的文獻(xiàn)報(bào)道

3、稱人源Coronin1A與致病性結(jié)核分枝桿菌在機(jī)體內(nèi)存活有關(guān)，其中Coronin1A在結(jié)核分枝桿菌感染過程中主要參與調(diào)節(jié)吞噬小體與溶酶體的融合形成吞噬溶酶體的過程。另外，在麻風(fēng)分枝桿菌感染過程中，人源Coronin1A也被認(rèn)為是能夠抑制Tol1-2受體介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路。因此，Coronin1A蛋白在細(xì)菌感染過程中能夠通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答和吞噬過程而有助于細(xì)菌逃避宿主的清除作用。
　　 在實(shí)驗(yàn)室前期研究中，我們首先從感染副

4、豬嗜血桿菌的肺泡巨噬細(xì)胞中克隆到了Coronin1A基因，在基因芯片中其轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)是上調(diào)的。為了調(diào)查豬Coronin1A基因在副豬嗜血桿菌感染過程中的分子機(jī)制，我們研究了豬Coronin1A在吞噬溶酶體形成和先天免疫應(yīng)答相關(guān)的NF-κB信號(hào)通路的作用。主要研究內(nèi)容如下:
　　 1.豬Coronin1A在副豬嗜血桿菌感染過程中可能參與阻止吞噬溶酶體的形成
　　 我們運(yùn)用免疫組化和STRING分析發(fā)現(xiàn)Coronin1A在

5、感染副豬嗜血桿菌的淋巴結(jié)、脾臟和肺臟中是上調(diào)表達(dá)的，說明豬Coronin1A與副豬嗜血桿菌感染相關(guān)。另外，我們發(fā)現(xiàn)了7個(gè)與Coronin1A相關(guān)的上調(diào)表達(dá)的差異表達(dá)基因，分別是Slc9a3r1、Ltb、I1-1β、Fcgr2β、Ly86、Cd14和Cc14，它們可能有助于副豬嗜血桿菌抵抗機(jī)體的吞噬作用或免疫應(yīng)答。再者，亞細(xì)胞定位結(jié)果表明豬Coronin1A主要分布于胞漿內(nèi)，與微管蛋白部分共定位，微管蛋白與形成吞噬溶酶體的皮質(zhì)微管網(wǎng)絡(luò)相關(guān)

6、。最重要的是，Coronin1A在感染副豬嗜血桿菌的豬肺泡巨噬細(xì)胞中定位的結(jié)果顯示，Coronin1A蛋白聚集于吞噬有活的副豬嗜血桿菌的吞噬小體上。相反，Coronin1A蛋白起初聚集于吞噬有熱致死細(xì)菌的吞噬小體上，隨即迅速從吞噬小體上離解開來，繼而菌體被運(yùn)送到溶酶體中，在吞噬溶酶體的作用下被機(jī)體清除。
　　 2.豬Coronin1A在副豬嗜血桿菌感染過程中有助于抑制NF-κB信號(hào)通路
　　 我們通過相對(duì)定量PCR和LP

7、S、Poly(I∶C)體外刺激實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)豬Coronin1A主要表達(dá)于造血組織及細(xì)胞中，而免疫刺激實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LPS和Poly(I∶C)均能夠在體外刺激豬Coronin1A基因的表達(dá)。另外，豬Coronin1A能夠抑制NF-κB的激活，其機(jī)制是通過抑制IκBα的降解和p65的核轉(zhuǎn)位。并且豬Coronin1A的過表達(dá)能夠通過抑制NF-κB信號(hào)通路從而導(dǎo)致NF-κB調(diào)控的下游炎性因子（IL-6、IL-8和COX-2）的下調(diào)表達(dá)。再者，我們研究發(fā)