IT-ISJ標(biāo)記在加工蘋果品種遺傳關(guān)系研究中的應(yīng)用.pdf

1、本研究以魯加1號(hào)（MalusdomesticaBorkh.cv.Lujia1）等31個(gè)加工蘋果品種為試材，采用IT-ISJ標(biāo)記（IntronTargetedIntron-exonSpliceJunction，即內(nèi)含子—外顯子拼接位點(diǎn)標(biāo)記）技術(shù)，建立了蘋果IT-ISJ標(biāo)記分析技術(shù)體系，分析了供試加工蘋果品種的遺傳關(guān)系。
　　 1、比較了加工蘋果品種基因組DNA提取方法
　　 比較了改良CTAB法和無(wú)需液氮的CTAB法。結(jié)果

2、表明，無(wú)需液氮的CTAB法獲得的DNA純度與改良CTAB法相當(dāng)，簡(jiǎn)便易行，但DNA濃度較低。改良CTAB法可以有效地去除蛋白質(zhì)和多糖類雜質(zhì)，獲得的DNA純度和濃度都比較理想。
　　 2、建立了加工蘋果品種IT-ISJ分析技術(shù)體系
　　 優(yōu)化了蘋果IT-ISJ分析中PCR擴(kuò)增酶、模板DNA、引物的濃度，篩選了PCR反應(yīng)中的最適溫度。研究表明，加工蘋果品種IT-ISJPCR反應(yīng)體系采用TIANGEN公司生產(chǎn)的2×TaqPCR

3、MasterMix，使用15μl的反應(yīng)體系為宜。反應(yīng)體系中含TaqPCRMasterMix7.5μl、濃度約為20ngμl-1的模板DNA2μl，以及10ngμl-1的引物組合各0.75μl。擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min，94℃45sec，50℃45sec，72℃1min，總共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保溫。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，應(yīng)用銀染技術(shù)檢測(cè)擴(kuò)增和電泳結(jié)果。
　　 3、篩選了87對(duì)適合加工蘋果品種IT-

4、ISJ分析的多態(tài)性引物組合
　　 選用正向引物8個(gè)，反向引物34個(gè)，并將正反向引物進(jìn)行兩兩組合，對(duì)配置的272對(duì)引物組合進(jìn)行了篩選，獲得了87對(duì)具有多態(tài)性的引物組合，其中有5對(duì)引物組合表現(xiàn)出很高的多態(tài)性，可對(duì)需要進(jìn)行鑒別的加工蘋果品種進(jìn)行有效的區(qū)分。這5對(duì)組合分別是:IT-ISJ13F/IT-ISJ14R、IT-ISJ13F/IT-ISJ16R、IT-ISJ13F/IT-ISJ43R、IT-ISJ14F/IT-ISJ43R、IT

5、-ISJ15F/IT-ISJ16R。
　　 4、計(jì)算了加工蘋果品種之間的相似系數(shù)，繪制了聚類分析圖
　　 利用NTSYS-2.1軟件中的Jaccard方法計(jì)算了各供試品種之間的相似系數(shù)，采用UPGMA法進(jìn)行了聚類分析，計(jì)算出了各加工蘋果品種組合間的遺傳距離，繪制了31個(gè)供試品種的聚類樹(shù)狀圖。結(jié)果表明，供試的31個(gè)蘋果品種的相似系數(shù)平均值為0.49，變異范圍為0.49±0.37。其中，倭錦和邦扎相似系數(shù)最小，僅為0.26;

6、魯加2號(hào)和魯加6號(hào)相似系數(shù)最大，達(dá)到了0.86。供試品種中相似系數(shù)大于0.50的組合有182個(gè)，占所有供試組合總數(shù)的39.3‰而相似系數(shù)小于0.50的組合有283個(gè)，占所有供式組合總數(shù)的60.7％，說(shuō)明品種之間存在較大的遺傳差異。在相似系數(shù)為0.50時(shí)，供試的31個(gè)蘋果品種可以分為7組。其中，其中第一組是倭錦（組），第二組是酸王（組），第三組是邦扎（組），第四組是特早紅（組），這四組的品種與其它品種之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，因此都是單獨(dú)成組。第

7、五組是釀酒品種組，包括5個(gè)單寧含量較高的品種（美娜、甜格力、苦開(kāi)麥、苦緋甘、大比耐）。第六組為制汁品種組，包括9個(gè)傳統(tǒng)的制汁品種:瑞丹、瑞林、瑞拉、小黃、貝當(dāng)、上林、瑞蓮娜、甜麥、澳洲青蘋，說(shuō)明傳統(tǒng)制汁品種之間具有相近的親緣關(guān)系。第七組為柱型品種組，包括13個(gè)品種，其中有新培育的加工品種（魯加1號(hào)～8號(hào)）和新品種的親本特拉蒙以及與特拉蒙相關(guān)的旭、威塞克旭、塔斯坎和特珍，這13個(gè)品種有共同的原始親本旭，親緣關(guān)系相近，因此聚為一組。