人工microRNAs在MARC-145細(xì)胞中抑制高致病性PRRSV的初步研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是一種重要的豬傳染性疾病，對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展構(gòu)成極大威脅。2006～2007年，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(H-PRRSV)引起的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(HP-PRRS)先后波及全國(guó)范圍內(nèi)約22個(gè)省，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　 PRRSV是單股正鏈RNA病毒，其基因組既是轉(zhuǎn)錄的模板，也是病毒核酸復(fù)制的模板，因而成為RNA干擾(RNA interference，RNAi)作用的

2、理想靶標(biāo)。近年來(lái)，多項(xiàng)研究致力于通過(guò)小發(fā)夾RNA(short hairpin RNAs，shRNAs)抑制PRRSV復(fù)制。盡管這些研究提供了一種抗PRRSV感染的新思路，但是，對(duì)于在RNAi中發(fā)揮關(guān)鍵作用的小分子干擾RNA(small interference RNA,siRNA)的形成而言，shRNA并非是最適底物。此外，通常由PolⅢ啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的shRNA，既不能實(shí)現(xiàn)組織特異性表達(dá)，還可能擾亂體內(nèi)正常microRNAs被加工成熟

3、的過(guò)程，產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性作用。
　　 最近的研究表明，經(jīng)內(nèi)源性microRNA(miRNA)代謝途徑被加工成熟的人工miRNA(artificial miRNA,amiRNA)能誘導(dǎo)比shRNA更強(qiáng)的RNAi效應(yīng)，而產(chǎn)生毒性作用的危險(xiǎn)卻更小。鑒于此，本研究設(shè)計(jì)了分別靶向H-PRRSV主要結(jié)構(gòu)蛋白GP5、M蛋白編碼基因的5個(gè)amiRNAs，即amirGP5-243、amirGP5-370、amirM-82、amirM-217和ami

4、rM-263，并將它們重組到一個(gè)基于小鼠miR-155設(shè)計(jì)的由PolⅡ啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的pre-amiRNA表達(dá)載體上，使得這些amiRNAs能夠像內(nèi)源性的microRNA一樣被加工成熟，從而有望更加高效和安全地在體內(nèi)發(fā)揮RNAi作用。
　　 Stem-loop RT-PCR實(shí)驗(yàn)證明重組干擾質(zhì)粒在MARC-145細(xì)胞內(nèi)能表達(dá)出成熟的amiRNAs。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)表明，5個(gè)amiRNAs對(duì)靶基因表達(dá)的抑制效率均在70％以上。

5、
　　 為了觀察amiRNAs在H-PRRSV感染過(guò)程中對(duì)靶基因表達(dá)和病毒復(fù)制的抑制作用，本研究進(jìn)行了細(xì)胞病變分析、相對(duì)熒光定量PCR、間接免疫熒光和Western blot檢測(cè)。結(jié)果表明，amirGP5-370能在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平有效抑制靶基因的表達(dá)，并能抑制H-PRRSV在MARC-145細(xì)胞中的復(fù)制。當(dāng)amirM-263與其自身串聯(lián)一次后置于同一個(gè)表達(dá)框中時(shí)，串聯(lián)表達(dá)的amirM-263能有效抑制H-PRRSV感染過(guò)程中靶基

6、因的表達(dá)和病毒復(fù)制。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明，串聯(lián)表達(dá)amirGP5-370和amirM-263能夠同時(shí)抑制GP5與M蛋白編碼基因表達(dá)。
　　 干擾素信號(hào)通路在RNAi作用中被激活是造成脫靶效應(yīng)的主要原因之一。干擾素信號(hào)通路標(biāo)記基因的檢測(cè)結(jié)果表明，當(dāng)amirGP5-370和amirM-263在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量足以發(fā)揮有效RNAi作用時(shí)，干擾素信號(hào)通路并不會(huì)被激活。
　　 基于慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi被認(rèn)為是目前在抗病毒感染的

7、治療策略中最具希望的的方法之一。本研究成功包裝出重組慢病毒Lenti-amirGP5-370、Lenti-amirM-263-M-263和Lenti-negative amiRNA，并獲得了重組慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的MARC-145細(xì)胞株。
　　 本研究不僅提供了一種利用amiRNA抗H-PRRSV感染的新策略，也通過(guò)包裝出重組慢病毒和獲得穩(wěn)定表達(dá)amiRNA的細(xì)胞株，為進(jìn)行豬體內(nèi)的RNAi實(shí)驗(yàn)，研究可能的病毒逃逸機(jī)制，及研究組成性高