非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重鏈A蛋白羧基端在PRRSV感染Marc-145細(xì)胞中的作用.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)感染導(dǎo)致的一種急性傳染病。該病能引起懷孕母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，仔豬與育肥豬則表現(xiàn)為明顯的呼吸道癥狀，仔豬斷奶前死亡率增高。目前PRRS已經(jīng)遍及全球主要養(yǎng)豬的國(guó)家和地區(qū)，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　 PRRSV通過(guò)與細(xì)胞膜表面的特異性受體結(jié)合，利用細(xì)胞內(nèi)吞作用

2、感染易感細(xì)胞?，F(xiàn)已報(bào)道的存在于Marc-145細(xì)胞上的PRRSV的受體有CD163和波形蛋白。CD163屬于富含半胱氨酸超家族的清道夫受體蛋白，起協(xié)助PRRSV脫衣殼和將病毒基因組RNA釋放到胞漿的作用。波形蛋白與其它中間細(xì)絲蛋白組成的多聚體可能參與PRRSV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和轉(zhuǎn)移。
　　 2008年，Zhou等用針對(duì)PRRSV GP5蛋白抗體的抗獨(dú)特型抗體(Mab2-5G2)通過(guò)免疫共沉淀的方法從PAM和MA-104細(xì)胞中提取出

3、一個(gè)分子量約230KD的可溶性蛋白，該蛋白為非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重鏈A(Nonmuscle myosin heavy chainⅡ-A，NMHCⅡ-A)。非肌肉肌球蛋白Ⅱ型(NMⅡ)廣泛存在于生物細(xì)胞中，在整個(gè)細(xì)胞周期，包括細(xì)胞遷移、胞質(zhì)分裂、細(xì)胞吸附和細(xì)胞形態(tài)變化等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。最新的研究結(jié)果證明NMHCⅡ-A作為Ⅰ型單純皰疹病毒進(jìn)入易感細(xì)胞的功能性受體。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)NMHCⅡ-A蛋白的羧基端對(duì)PRRSV感染Marc-14

4、5細(xì)胞有阻斷作用。
　　 為進(jìn)一步驗(yàn)證NMHCⅡ-A在PRRSV感染Marc-145細(xì)胞中的作用，本研究以NMHCⅡ-A蛋白羧基端為研究對(duì)象，探究其與單克隆抗獨(dú)特型抗體Mab2-5G2的結(jié)合位點(diǎn)及其在PRRSV感染Marc-145細(xì)胞中的作用，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn):
　　 第一:NMHCⅡ-A與Mab2-5G2結(jié)合位點(diǎn)的鑒定及各蛋白對(duì)PRRSV感染Mare-145細(xì)胞抑制作用的驗(yàn)證。首先對(duì)NMHCⅡ-A羧基端大小為310個(gè)氨基

5、酸的蛋白(命名為PRA)進(jìn)行分段表達(dá)和部分氨基酸的缺失表達(dá)，經(jīng)Ⅰ-ELISA和Western blot鑒定NMHCⅡ-A與Mab2-5G2的結(jié)合域?yàn)閍a1677-1713。通過(guò)PRA蛋白的進(jìn)一步分段表達(dá)和氨基酸的定點(diǎn)突變確定aa1678，aa1682和aa1700為NMHCⅡ-A與Mab2-5G2的結(jié)合位點(diǎn)。在活細(xì)胞工作站實(shí)時(shí)觀察各蛋白對(duì)細(xì)胞周期無(wú)影響的前提下，通過(guò)病毒中和實(shí)驗(yàn)(VirusNeutralization Test，VNT)

6、和熒光聚焦中和實(shí)驗(yàn)(Fluorescence Focus Neutralization，F(xiàn)FN)驗(yàn)證了各蛋白對(duì)PRRSV感染Marc-145細(xì)胞的抑制作用，熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NMHCⅡ-A和CD163 mRNA轉(zhuǎn)錄水平和Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NMHCⅡ-A和CD163蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示PRA蛋白及包含結(jié)合位點(diǎn)的蛋白有明顯的抑制作用，而包含一個(gè)或不包含結(jié)合位點(diǎn)的蛋白抑制作用明顯降低，并且蛋白對(duì)細(xì)胞內(nèi)NMHCⅡ-A和C

7、D163 mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平無(wú)影響。證明NMHCⅡ-A與Mab2-5G2的結(jié)合位點(diǎn)在PRRSV感染Marc-145細(xì)胞中發(fā)揮作用。
　　 第二-PRA蛋白的真核表達(dá)及對(duì)PRRSV感染的抑制作用。利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化得到天然構(gòu)象的PRA蛋白。PRA蛋白與Marc-145細(xì)胞特異性結(jié)合，將PRRSV的感染延遲24h并且感染96h時(shí)其CPE明顯弱于對(duì)照細(xì)胞。在PRRSV感染24h時(shí)，PRA蛋白

8、能使其感染效率降低60％。但真核表達(dá)的PRA蛋白不能完全抑制PRRSV的感染，推測(cè)其他相關(guān)因素，如與PRRSV細(xì)胞受體的相互作用相關(guān)。
　　 第三:鑒定PRA蛋白與Marc-145細(xì)胞內(nèi)其它受體的相互作用。免疫共沉淀驗(yàn)證PRA蛋白與Marc-145細(xì)胞內(nèi)NMHCⅡ-A和CD163相互作用，并且PRA的四段互不重疊的分段蛋白都可與NMHCⅡ-A和CD163相互作用。結(jié)果充分證明NMHCⅡ-A與CD163特異性結(jié)合。