華中地區(qū)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分子進化特征研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以妊娠母豬嚴重繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征的傳染病。該病最早于1987年報道于美國南部,現(xiàn)已遍及世界各地,給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。
　　 2006年,我國暴發(fā)了一種以高熱、高發(fā)病率和高死亡率為特征的“豬高熱綜合癥”。通過國內(nèi)學(xué)者的大量研究,證實高致病性PRRSV變異株是“豬高熱綜合癥”的主要病原。針對這種新的PRRS,本研究

2、開展了病毒的分離與鑒定,分析了分離毒株與國內(nèi)外代表毒株的遺傳進化關(guān)系,建立了RT-PCR診斷方法,并對其主要免疫原性基因ORF5進行了修飾與改造。主要研究內(nèi)容包括
　　 1.高致病性PRRSV的分離、鑒定
　　 利用Marc-145細胞對“豬高熱綜合癥”期間發(fā)病豬的組織樣品進行病毒分離,并通過RT-PCR、電鏡觀察以及間接免疫熒光等試驗證實分離的病毒為PRRSV。對分離的毒株WUH1、HG、GD、XA進行了本動物回歸試驗

3、,結(jié)果人工感染豬表現(xiàn)出與臨床上“豬高熱綜合癥”一致的臨床癥狀,感染豬發(fā)病率達100％,死亡率高達80％,從而確定分離的這四株毒株均為高致病性PRRSV。
　　 2.高致病性PRRSV WUH1株的全基因組序列分析
　　 通過RT-PCR分段擴增并測定了PRRSV WUH1株的全基因組序列,序列分析結(jié)果表明:WUH1株屬于美洲型毒株,其基因組兩端非編碼區(qū)5’UTR和3’UTR各存在一個堿基的缺失,且Nsp2蛋白中存在30個

4、氨基酸的不連續(xù)缺失。與國內(nèi)分離的變異株JXA1的基因組同源性高達98.7％。遺傳進化分析表明WUH1與國內(nèi)高致病性PRRSV親緣關(guān)系較近,有著共同的祖先。
　　 3.華中地區(qū)PRRSV分離株Nsp2、ORF3和ORF5基因的序列特征分析
　　 對從華中地區(qū)分離的18株P(guān)RRSV分離株的Nsp2、ORF3和ORF5基因進行序列分析,結(jié)果表明:有17株病毒的Nsp2存在30個氨基酸的不連續(xù)缺失,缺失位置與WUH1相同,只有1

5、株未發(fā)生此缺失。根據(jù)所建立的遺傳進化樹確定這17株分離株與高致病性PRRSV的親緣關(guān)系較近,而另外1株被確定為疫苗株。同時還發(fā)現(xiàn)高致病性PRRSV ORF5基因編碼的GP5蛋白中的多處關(guān)鍵氨基酸位點都發(fā)生了突變。GP3的抗原表位中的氨基酸發(fā)生了突變。
　　 4.PRRSV變異株RT-PCR檢測方法的建立
　　 為了便于鑒別高致病性PRRSV和經(jīng)典毒株,參考經(jīng)典毒株及高致病性毒株的基因序列,在Nsp2基因缺失區(qū)的兩端保守區(qū)

6、設(shè)計并合成了一對引物,經(jīng)典毒株擴增片段為508bp,而高致病性PRRSV擴增片段為418bp,建立了能區(qū)分高致病性PRRSV和經(jīng)典PRRSV的RT-PCR診斷方法。試驗證明該方法特異性良好,敏感性高。用此方法對華中地區(qū)PRRSV的流行情況進行了調(diào)查,表明華中地區(qū)PRRSV陽性率高達60.45％,且流行毒株主要為高致病性PRRSV變異株。
　　 5.重組毒株Em2007的全基因組及致病性分析
　　 在臨床病料檢測時發(fā)現(xiàn)了N

7、sp2基因存在更多缺失的毒株,分離該毒株并命名為Em2007。全基因組序列分析發(fā)現(xiàn):Em2007的Nsp2存在連續(xù)68個氨基酸的缺失,是一種新的Nsp2缺失變異株,且其5’端非編碼區(qū)有一個堿基的缺失。進一步的遺傳進化分析表明,Em2007是一株潛在的自然重組毒株,全基因組存在3個同源重組區(qū)域,其親本分別為WUH1和CH-1R。通過本動物的人工感染試驗,發(fā)現(xiàn)Em2007的毒力明顯強于CH-1a,但較WUH1株弱。
　　 6.中國大

8、陸PRRSV的遺傳變異分析
　　 對高熱病期間分離的82株P(guān)RRSV分離株的ORF5基因進行了序列測定和遺傳進化分析,發(fā)現(xiàn)這些流行毒株均為美洲型毒株。同經(jīng)典的PRRSV相比,糖基化位點的數(shù)量明顯增多,位置也發(fā)生了變化,而且抗原性也不同于以前的疫苗株。收集了GenBank數(shù)據(jù)庫中1996-2008年間我國所有PRRSV分離株的全基因組序列和ORF5基因序列,從全基因組和ORF5基因兩個方面對PRRSV在我國的流行規(guī)律及遺傳進化關(guān)系

9、進行了綜合的分析,發(fā)現(xiàn)目前我國至少存在4種遺傳關(guān)系不同的亞群。
　　 7.人工合成的修飾型高致病性PRRSV ORF5基因的免疫原性研究
　　 為了獲得用于研制高致病性PRRSV新型疫苗的良好靶基因,針對高致病性PRRSV變異株ORF5基因的特征,將人工合成的編碼輔助性T淋巴細胞表位的核苷酸序列插入高致病性PRRSV ORF5的中和表位和誘騙表位間,將中和表位兩端的糖基化位點(N30、N34、N35和N51)消除,并對O