中華絨螯蟹螺原體抗原膜蛋白篩選及其ORF0313蛋白毒力功能研究.pdf

1、索取號：S91／4140：141202126南京師勉太掌碩士學(xué)位論文胤鰳中華絨螯蟹螺原體抗原膜蛋白篩選及其0RF0313蛋白毒力功能研究，研究生：指導(dǎo)教師：培養(yǎng)單位：一級學(xué)科：二級學(xué)科：完成時間：答辯時間：。王健王文生命科學(xué)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖2017年3月12日2017年5月19日㈣3㈣9哪2㈣2Ⅲj1㈣33ⅢY摘要摘要中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)是一種具有經(jīng)濟價值的淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。伴隨養(yǎng)殖集約化程度的提高，由細菌

2、等病原微生物引發(fā)的疾病越來越頻繁，阻礙了中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。在中華絨螯蟹感染的疾病中，顫抖病是危害最為嚴重的病害之一。本課題組已證實中華絨螯蟹螺原體(Spiroplasmaeriocheiris)是引發(fā)顫抖病的病原體，并已完成很多Seriocheiris相關(guān)的研究，如病原檢測、基因組測序、治療藥物篩選等，但是關(guān)于&eriocheir&膜上與致病相關(guān)蛋白的研究還很少。為此，本碩士論文在基因組學(xué)、免疫蛋白組學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)上，進行了螺

3、原體膜蛋白免疫蛋白組學(xué)分析，從篩選出的抗原膜蛋白中選取ORF0313蛋白做了基因克隆、蛋白表達、毒性等研究。本論文為探明中華絨螯蟹螺原體侵染宿主機理以及為更好預(yù)防該病原對宿主侵染提供理論基礎(chǔ)。論文包括以下三個部分：1免疫蛋白組學(xué)方法篩選膜蛋白中的抗原蛋白本實驗利用免疫沉淀方法，將等量中華絨螯蟹螺原體膜蛋白分別與陽性、陰性血清結(jié)合，分別篩選出蛋白32個和6個，其中2個相同，最終篩選出30個抗原膜蛋白，其中22個已知蛋白、8個假定蛋白。22

4、個已知蛋白包括已證實的外膜蛋白：丙酮酸激酶、烯醇酶、3磷酸甘油醛脫氫酶、丙酮酸脫氫酶E2和DnaK，這些蛋白在病原侵染宿主細胞過程中扮演著重要的角色。2ORF0313蛋白生物信息學(xué)分析、基因克隆、點突變及蛋白原核表達利用生物信息學(xué)方法對ORF0313蛋白進行了信號肽、跨膜螺旋區(qū)、二級結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示該蛋白可能為螺原體分泌蛋白或膜蛋白。為了對該蛋白的功能做進一步研究，根據(jù)中華絨螯蟹螺原體全基因組序列，克隆出了ORF0313基因序列，長度

5、為1091bp，生物信息學(xué)軟件預(yù)測得到：ORF0313蛋白理論分子量約為40kDa，等電點為49。然后將ORF0313基因連接克隆載體pSIMPLE19，并利用試劑盒進行了點突變，將TGA變成TGG，將突變成功的ORF0313進行雙酶切，并與pET28a表達載體連接，構(gòu)建成pETORF0313載體導(dǎo)入表達感受態(tài)細胞(BL21)中，進行原核表達，并利用Ni柱進行蛋白純化。3ORF0313蛋白抗體制備、細胞定位及毒性實驗將純化后的ORF03