番木瓜類胡蘿卜素生物合成途徑部分酶基因cDNA的克隆與分析.pdf

1、番木瓜(Carica papaya L.)是熱帶、亞熱帶地區(qū)廣泛種植的果樹,是類胡蘿卜素的重要植物資源。類胡蘿卜素是具有廣泛生物功能的一大類重要的植物色素。本研究以紅肉番木瓜‘馬來10號’果肉為材料,利用RACE和RT-PCR技術克隆類胡蘿卜素生物合成途徑中八氫番茄紅素脫氫酶基因(phytoenedesaturase,PDS)、ξ-胡蘿卜素脫氫酶基因(ξ-carotene desaturase,ZDS)和番茄紅素β-環(huán)化酶基因(lyco

2、pene-β-cyclase,LCY-B)的cDNA序列,并采用半定量RT-PCR法分析該途徑中八氫番茄紅素合成酶基因(phytoene synthase,PSY)、PDS、ZDS和LCY-B四基因在果實不同發(fā)育時期的表達水平。本研究為闡明番木瓜果肉顏色形成的分子機理奠定了基礎,也在分子水平充實了類胡蘿卜素生物合成的理論研究。
　　 1利用RACE和RT-PCR技術克隆番木瓜PDS基因cDNA全長
　　 利用GenBan

3、k己登錄的番木瓜PDS基因片段,通過RACE技術獲得其5’端和3’端序列,從而得到番木瓜PDS基因cDNA(GenBank登錄號為DQ666830)全長2202bp,最大開放讀碼框為1752bp,編碼583個氨基酸,預測相對分子量為65110.0,等電點為6.26,5’端有223bp的非翻譯區(qū),3’端包含227bp的非編碼序列;根據cDNA全長推導氨基酸序列與番茄、溫州蜜柑、玉米等高等植物PDS基因的氨基酸序列進行同源性對比分析并構建系

4、統(tǒng)進化樹。
　　 2利用RACE和RT-PCR技術克隆番木瓜ZDS基因cDNA全長
　　 根據GenBank己登錄的番木瓜ZDS基因3’端序列,通過RACE技術獲得其5’端序列,得到番木瓜ZDS基因cDNA(GenBank登錄號為DQ666829)全長1951bp,最大開放讀碼框為1659bp,編碼552個氨基酸,預測分子量為60888.8,等電點為7.52,5’端有25bp長的非翻譯區(qū),3’端包含267bp的非編碼序列

5、;根據cDNA全長推導氨基酸序列與溫州蜜柑、擬南芥、玉米等高等植物ZDS基因的氨基酸序列進行同源性分析并構建系統(tǒng)進化樹。
　　 3利用RT-PCR技術克隆番木瓜LCY-B基因的ORF
　　 依據GenBank已登錄的番木瓜LCY-B基因的DNA全長,通過RT-PCR技術獲得其ORF序列(GenBank登錄號為FJ599643)為1613bp,最大開放讀碼框為1512bp,編碼503個氨摹酸,預測分子量為56736.5,等

6、電點為6.62,5’端有76bp長的非翻譯區(qū),3’端包含25bp的非編碼序列;根據cDNA全長推導氨基酸序列與溫州蜜柑、番茄、水仙等高等植物LCY-B基因的氨基酸序列進行同源性分析并構建系統(tǒng)進化樹。
　　 4利用半定量RT-PCR分析番木瓜PSY、PDS、ZDS和LCY-B基因的表達
　　 以番木瓜Actin基因為陽性對照,檢測番木瓜PSY、PDS、ZDS和LCY-B四基因在果實膨大結束期、果皮破色期、果皮50％轉黃期和