香菇農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化及BCA基因轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、本項(xiàng)研究成功構(gòu)建了BCA基因的香菇表達(dá)載體pBHg-BCA。然后對(duì)香菇的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了探索，通過(guò)優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，建立了香菇的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系。并在此基礎(chǔ)上將BCA基因成功轉(zhuǎn)入香菇基因組中。主要研究成果如下： 1、以質(zhì)粒1300-pEGFP為出發(fā)質(zhì)粒，通過(guò)PCR擴(kuò)增將質(zhì)粒PCB-BCA中的BCA基因擴(kuò)增出來(lái)，并在其兩側(cè)加上KpnⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)，回收該片段后，將其插入質(zhì)粒1300-pEGFP中，替換掉EGFP基因，獲得重組質(zhì)

2、粒1300-BCA。然后在此基礎(chǔ)上，以質(zhì)粒pBHg為出發(fā)質(zhì)粒，通過(guò)PCR擴(kuò)增將質(zhì)粒1300-BCA中的BCA表達(dá)框(包括雙孢蘑菇的GPD啟動(dòng)子、BCA基因和35S終止子)擴(kuò)增出來(lái)，并在其兩側(cè)加上BamHⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)，回收該片段后，將其插入pBHg的多克隆位點(diǎn)處，獲得重組質(zhì)粒pBHg-BCA。成功構(gòu)建了BCA基因的香菇表達(dá)載體。 2、通過(guò)香菇的潮霉素抗性試驗(yàn)，確定了L0071的潮霉素致死濃度應(yīng)該在5μg/ml～10μg/m

3、l之間。據(jù)此將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的初篩濃度定為10μg/ml，復(fù)篩濃度定為20μg/ml。通過(guò)頭孢噻肟鈉對(duì)香菇的毒性試驗(yàn)，確定了Cef的最佳抑菌濃度為400μg/ml。 3、通過(guò)借鑒Chen等對(duì)雙孢蘑菇的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，從不同農(nóng)桿菌菌株、不同香菇組織、侵染菌液的濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間和AS濃度六個(gè)方面對(duì)香菇的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化進(jìn)行探索，以找到最佳的轉(zhuǎn)化條件。最終確定了，農(nóng)桿菌菌株EHA105為較優(yōu)的侵染菌株，香菇的幼嫩菌褶組織為最佳轉(zhuǎn)化材料