大豆尖鐮孢菌的快速分子檢測(cè)與遺傳多樣性分析及品種抗性研究.pdf

1、大豆(Glycine max)是重要的經(jīng)濟(jì)作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位。近年來(lái)，由尖鐮孢菌引起的大豆枯萎病范圍逐漸擴(kuò)大，危害日益突出。該病害是一種土傳病害，病菌生活力極強(qiáng)，可在土壤中生存多年。國(guó)內(nèi)外大量研究和生產(chǎn)實(shí)踐證明，選育和利用抗病品種是防治大豆枯萎病最經(jīng)濟(jì)有效的措施。我國(guó)抗枯萎病育種的進(jìn)展與大豆生產(chǎn)需求現(xiàn)狀相差甚遠(yuǎn)，主要原因是研究方法和手段相對(duì)落后，有關(guān)的基礎(chǔ)研究，如尖鐮孢菌的鑒定、遺傳多樣性、抗性鑒定等研究不夠系統(tǒng)和深入。

2、r>　　 本研究在大豆枯萎病發(fā)生時(shí)期，從全國(guó)主要大豆種植地區(qū)采集大豆枯萎病病樣，采用傳統(tǒng)形態(tài)鑒定和分子生物學(xué)手段相結(jié)合的方法，對(duì)大豆枯萎病病原菌進(jìn)行分離鑒定，建立了尖鐮孢菌的快速分子檢測(cè)體系，同時(shí)對(duì)大豆枯萎病病原菌的遺傳多樣性和品種抗性進(jìn)行了研究。
　　 1.從我國(guó)各大豆產(chǎn)區(qū)采集大豆枯萎病標(biāo)本285份，通過(guò)室內(nèi)分離、培養(yǎng)獲得126株真菌分離物。按照柯赫氏法則，經(jīng)過(guò)致病性試驗(yàn)證實(shí)，得到97株致病菌。經(jīng)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，

3、得到61株尖鐮孢菌(Fusarium oxysporum)。
　　 2.根據(jù)尖鐮孢菌(F.oxysporum)和其它病原真菌的甾醇14α-去甲基化酶基因(CYP51C)序列間的差異，設(shè)計(jì)了特異性引物C1/C2和C3/C4。檢測(cè)體系可以特異地從F.oxysporum菌株中擴(kuò)增到一條699 bp左右的條帶。引物C1/C2對(duì)F.oxysporum基因組DNA的檢測(cè)靈敏度為100ng，以引物C3/C4和C1/C2進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增后，檢

4、測(cè)靈敏度提高到1 pg，檢測(cè)靈敏度至少提高105倍。引物C1/C2對(duì)土壤中分生孢子的檢測(cè)靈敏度達(dá)到102個(gè)孢子/克土，套式PCR檢測(cè)體系可以將靈敏度提高到1個(gè)孢子/克土。同時(shí)，引物C1/C2對(duì)發(fā)病植株組織也能特異性的檢測(cè)到F.oxysporum的存在。進(jìn)一步建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系，可以對(duì)土壤和發(fā)病植物中病原菌精確定量。
　　 3.利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)，對(duì)采自我國(guó)不同地區(qū)的大豆枯萎病病原菌尖鐮孢菌(F.o

5、xysporum)進(jìn)行遺傳多樣性分析，篩選到10條多態(tài)性隨機(jī)引物，共產(chǎn)生75條RAPD條帶，其中55條為多態(tài)性條帶，占73.3％。利用UPGMA法對(duì)DNA擴(kuò)增圖譜進(jìn)行聚類分析，以遺傳距離0.68為閾值，55個(gè)菌株可分為9個(gè)遺傳群體，表明我國(guó)大豆枯萎病病原菌中具有豐富的種內(nèi)遺傳多樣性。
　　 4.采用孢子懸浮液蘸根接種鑒定方法，對(duì)172份大豆品種進(jìn)行抗枯萎病鑒定篩選，鑒定得到5份抗大豆枯萎病品種:皖豆28，中黃13，中黃51，中作