大黃魚內(nèi)臟白點(diǎn)病的研究.pdf

1、2011年1月，浙江省象山港網(wǎng)箱養(yǎng)殖的大黃魚(Pseudosciaena crocea)出現(xiàn)了一種嚴(yán)重病害，病魚體表無明顯癥狀，解剖可見脾、腎等內(nèi)臟出現(xiàn)白點(diǎn)或小結(jié)節(jié)，造成了大黃魚的大量死亡。從患病大黃魚內(nèi)臟中分離到的病原菌，通過生理生化和分子生物學(xué)方法鑒定，以及人工感染等確定其為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)；同時(shí)通過組織切片方法，發(fā)現(xiàn)在病魚的肝臟、腎臟、脾臟等組織均發(fā)生炎性病變，細(xì)胞變形或解體，在脾、腎等組織中，纖

2、維組織增生，圍繞菌體形成肉眼見到的“白點(diǎn)”。
　　 本研究中建立了一種快速檢測(cè)致病菌的可視化環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)方法，針對(duì)惡臭假單胞菌基因的保守DNA序列(rpoN)設(shè)計(jì)4條特異性引物(兩條內(nèi)引物FIP、BIP和兩條外引物F3、B3)進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。優(yōu)化反應(yīng)條件后檢測(cè)到惡臭假單胞菌PT01純培養(yǎng)物的靈敏度為每個(gè)反應(yīng)4.8 cfu，是傳統(tǒng)PCR反應(yīng)靈敏度的10倍左右。本方法能夠特異性地從10種不同的革蘭氏陰性菌中區(qū)分出惡臭

3、假單胞菌，還能夠檢測(cè)到感染魚體內(nèi)的致病菌DNA。此外，可視化LAMP方法能夠有效避免交叉感染，將SYBR green I埋入高熔點(diǎn)微晶蠟中，石蠟塊在反應(yīng)前放入管中，反應(yīng)后85℃時(shí)石蠟融化，染料就能與DNA擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合?？梢暬疞AMP方法的簡(jiǎn)單，高靈敏度，高特異性以及低成本的特點(diǎn)使其有望發(fā)展成為快速檢測(cè)惡臭假單胞菌的有效手段。
　　 通過杯碟法檢測(cè)惡臭假單胞菌胞外產(chǎn)酶情況，檢測(cè)菌株均不產(chǎn)生酪蛋白酶、淀粉酶、磷脂酶等胞外酶，且不具有

4、溶血性。通過銀染法觀察到惡臭假單胞菌生物膜的形成，確定其容易形成生物膜結(jié)構(gòu)。然后制備了脂多糖(LPS)、外膜蛋白(OMP)、全菌抗原(FKC)等多種免疫成分，對(duì)大黃魚進(jìn)行人工免疫，21 d后通過測(cè)定血清中凝集抗體效價(jià)、溶菌酶活性、白細(xì)胞吞噬活性以及免疫保護(hù)率來探討這些保護(hù)性抗原對(duì)大黃魚免疫機(jī)能的影響。經(jīng)FKC免疫后的大黃魚，其血液白細(xì)胞的吞噬活性和血清中的溶菌酶活性在一定程度上有所上升，但與對(duì)照組相比并無顯著差異(P＞0.05)。但FK