大黃魚粘液抗體及抗體分泌細胞的研究.pdf

1、本研究以哈氏弧菌、大黃魚、免疫多糖和中華絨螯蟹為試驗材料，應用微生物技術(shù)、蛋白質(zhì)技術(shù)和免疫學技術(shù)等試驗方法進行了大黃魚和中華絨螯蟹抗病力的初步研究、完成了對大黃魚免疫球蛋白的分離純化、粘液抗體的檢測以及特異性抗體分泌細胞（ASCs）的檢測，獲得的主要結(jié)果如下： 1．用哈氏弧菌的福爾馬林滅活菌體（FKC）和從哈氏弧菌中提取的菌體粗脂多糖（LPS）及粗外膜蛋白（OMP）作為免疫原，分別經(jīng)胸鰭基部接種大黃魚，通過測定不同接種時間后大黃

2、魚血清的凝集抗體效價、血液中吞噬細胞的吞噬活性和溶菌酶活性的大小，以及活菌攻毒實驗，測定了供試魚在免疫接種28d后的保護力。結(jié)果表明3種免疫原對大黃魚均具有較強的免疫原性，血液中吞噬細胞的吞噬活性和溶菌酶活性均明顯高于對照組，同時也發(fā)現(xiàn)血清中的凝集抗體效價與免疫保護力無直接相關(guān)性。 2．采用飽和硫酸銨分步鹽析法結(jié)合Sephrose-4B凝膠柱層析，分離和純化大黃魚免疫球蛋白，將其作為免疫原再免疫接種新西蘭大白兔制備免抗大黃魚免疫

3、球蛋白的抗體，純化后用辣根過氧化物酶（HRP）標記，建立了間接ELISA測定大黃魚抗體的方法。試驗的最佳反應條件為：酶標抗體1：3000稀釋；抗原最適工作濃度為15μg／mL；血清以1：80稀釋時，陰陽性血清的OD值之比最大，故選擇1：80為血清的最佳稀釋度；抗原4℃冰箱包被過夜為抗原的最佳包被條件；選擇底物的最佳反應時間為15min。 3．通過注射，口服和浸泡3種不同免疫方式接種大黃魚后，應用間接ELISA法對大黃魚皮膚粘液，

4、膽汁和血清中抗體水平進行檢測。結(jié)果表明，粘液抗體產(chǎn)生快，持續(xù)時間短，抗體水平低；血清抗體產(chǎn)生比較慢，持續(xù)時間長，抗體水平高。另外不同的免疫接種方式，能夠刺激魚體不同組織中抗體產(chǎn)生的水平也不同，浸泡免疫接種能夠有效的刺激粘膜產(chǎn)生抗體，并且在抗體水平上相對高于血清抗體；注射免疫后粘液抗體的變化，暗示出只有在循環(huán)系統(tǒng)中產(chǎn)生免疫應答后，才發(fā)生局部的粘液抗體；口服免疫接種后魚體粘液抗體和血清抗體水平都較低，暗示只有少量的抗原到達后腸。 4

5、．通過注射，口服和浸泡三種不同的免疫方式免疫大黃魚，應用ELISPOT方法測定不同免疫時間后大黃魚頭腎細胞，鰓細胞和血液白細胞中特異性抗體分泌細胞（ASC）數(shù)量的變化，結(jié)果表明：注射和浸泡大黃魚頭腎中產(chǎn)生了明顯高于對照組的特異性ASC，其中注射組中頭腎特異性ASC數(shù)量又遠遠超出其它免疫組，差異顯著，口服和對照組差異并不顯著。血液白細胞中特異性ASC的數(shù)量整體上遠遠少于頭腎中，注射組水平高于其它兩組，其中口服組與對照組相差無幾。對于鰓組織

6、中特異性ASC的檢測，出現(xiàn)最早的是浸泡組；而注射組前兩周沒發(fā)現(xiàn)特異性ASC，直到第三周才檢測到；口服組和對照組均未觀察到特異性ASC。結(jié)論：注射免疫能夠引起循環(huán)系統(tǒng)和局部粘液系統(tǒng)的免疫應答，但出現(xiàn)時間上并不同步；而浸泡免疫可以直接刺激產(chǎn)生粘液免疫應答，粘液抗體的產(chǎn)生具有一定的獨立性和敏感性。 5．在中華絨螯蟹的飼料中分別添加0mg/kg.B.W.，400.0mg/kg.B.W、600.0mg/kg.B.W.、800.0m/kg.

7、B.W.、1000.0mg/kg.B.W.和1200.0mg/kg.B.W的免疫多糖（酵母細胞壁），連續(xù)投喂中華絨螯蟹28d后，通過測定供試中華絨螯蟹的體重、投喂或注射患病中華絨螯蟹組織（漿）的攻毒方法，探討了口服免疫多糖（酵母細胞壁）對中華絨螯蟹生長速度和抗病力的影響。結(jié)果表明，在中華絨螯蟹的飼料中添加400.0mg/kg.B.W至1200.0mg/kg.B.W的免疫多糖（酵母細胞壁），對中華絨螯蟹的生長速度和身體顏色等沒有顯著影響；