雙組分調(diào)控系統(tǒng)1910HK-RR調(diào)控豬鏈球菌2型致病性研究.pdf

1、豬鏈球菌病是由豬鏈球菌(Streptococcus suis,S.suis)引起的一種當前嚴重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的重要細菌性傳染病。根據(jù)莢膜多糖抗原成分不同,豬鏈球菌分33個血清型(1-31、33、35型和1/2型)。其中豬鏈球菌2型(Streptococcus suis serotype2,SS2)作為一種重要人畜共患傳染病病原,不僅影響著養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展,還嚴重危害著人類的健康,引起了社會的高度關(guān)注。近幾年,SS2已成為國內(nèi)外研究的熱點

2、,尤其是關(guān)于其分子致病與免疫機理方面的研究。
　　 病原微生物致病由多種毒力因子的協(xié)同作用而引起,這些毒力因子受某些調(diào)控系統(tǒng)的調(diào)控,形成一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。雙組分調(diào)控系統(tǒng)(Two-Component RegulatorySystem,TCS)是廣泛存在于細菌中的一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。它首先感應(yīng)外界環(huán)境的變化,繼而把信息傳給內(nèi)部系統(tǒng),導(dǎo)致細菌毒力因子等表達發(fā)生變化。大量研究證實,TCS參與調(diào)控細菌致病性、生長代謝、營養(yǎng)代謝、耐藥性及毒

3、力因子的表達等多種生物學功能。隨著我國豬鏈球2型05ZYH33和98HAH12菌株全基因組測序的完成,在SS2發(fā)現(xiàn)至少有15對雙組分調(diào)控系統(tǒng)。然而,在這些調(diào)控系統(tǒng)僅SalK-SalR和兩個“孤兒”調(diào)控因子RevS、CovR被研究報道。
　　 本論文選取了其中一對雙組分調(diào)控系統(tǒng)1910HK/RR為研究對象,開展了一系列生物學研究,以探討其與SS2野生菌株SC19(WT)致病性的關(guān)系。主要研究內(nèi)容包括:
　　 1.基因缺失突

4、變株△1910hk/rr和互補菌株CΔ1910hk/rr的構(gòu)建及鑒定
　　 參考SS2強致病株05ZYH33全基因組序列,設(shè)計引物,以四川分離的WT為親本株,提取其基因組DNA為模板,PCR分別擴增基因1910hk/rr上下游同源臂、開放閱讀框(ORF)和全長序列,利用溫度敏感型“自殺性”質(zhì)粒pSET4s,構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSET4s-1910hk/rr。將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到WT感受態(tài)細胞中,通過28℃和37℃溫度雙標記和抗生

5、素篩選,初步獲得1910hk/rr基因缺失菌株。應(yīng)用PCR、RT-PCR和測序?qū)ν蛔冎赀M一步鑒定,成功構(gòu)建基因缺失突變株△1910hk/rr。利用穿梭質(zhì)粒pAT18,將所缺失的基因1910hk/rr及其啟動子序列一起轉(zhuǎn)入相應(yīng)的基因缺失突變菌株△1910hk/rr中,通過PCR和RT-PCR鑒定,獲得了相應(yīng)的互補菌株CΔ1910hk/rr。
　　 2.WT、△1910hk/rr和C△1910hk/rr的體外生物學特性比較研究

6、>　　 在體外相同培養(yǎng)條件下,開展了WT、△1910hk/rr和CA1910hk/rr體外生物學特性比較研究。結(jié)果表明:△1910hk/rr的生長速率要低于WT和C△1910hk/rr。透射電鏡結(jié)果顯示,△1910hk/rr形態(tài)結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變。定性和定量的溶血性試驗結(jié)果表明,與WT相比,△1910hk/rr的細菌溶血活性并沒有發(fā)生顯著變化。中性粒細胞(PMN)介導(dǎo)的殺傷實驗結(jié)果顯示,雙組分調(diào)控系統(tǒng)1910HK/RR缺失后使得SS2抵抗

7、中性粒細胞(PMN)的殺傷能力降低。體外細胞粘附和侵染試驗結(jié)果表明,△1910hk/rr對HEp-2細胞的粘附和侵染能力降低,但是粘附能力下降更為顯著。
　　 3.雙組分1910HK/RR缺失后對SS2致病性的影響
　　 為了進一步評價雙組分調(diào)控系統(tǒng)1910HK/RR對SS2致病性的影響,在CD-1小鼠和斷奶仔豬身上開展了動物實驗。分別用菌株WT、△1910hk/rr和C△1910hk/rr感染CD-1小鼠。半數(shù)致死量(

8、LD50)結(jié)果為,△1910hk/rr為1.22×109CFU,而WT為4.14×107CFU野毒菌株,突變株是野生菌株的29.5倍,△1910hk/rr的毒力與WT相比下降非常顯著。發(fā)病率和存活率試驗:參考小鼠半數(shù)致死量的結(jié)果,采用了108CFU的劑量來進行試驗。分別用△1910hk/rr、C△1910hk/rr和WT感染小鼠,觀察12 d。其結(jié)果為:與WT相比,△1910hk/rr發(fā)病率降低,死亡率為10％,感染后小鼠腦和肺組織無明

9、顯的病理損傷。WT與C△1910hk/rr的死亡率分別為70％和80％。組織器官載菌量結(jié)果顯示,△1910hk/rr感染組小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦、血等組織活菌數(shù)都要低于WT。進一步以105CFU劑量感染5周齡左右斷奶仔豬。結(jié)果為:感染后48 h內(nèi)WT。組死亡率為66.7％(4/6)；存活的2頭仔豬也出現(xiàn)典型的癥狀,而△1910hk/rr組觀察到2ld,死亡率為16.7％(1/6)；心、肝、脾、肺、腎、腦、血液、關(guān)節(jié)等組織載菌量比較

10、分析發(fā)現(xiàn),△1910hk/rr組也低于WT組。以上結(jié)果說明,雙組分1910HK/RR缺失后SS2的致病性明顯降低。
　　 4.雙組分調(diào)控系統(tǒng)1910HK/RR調(diào)控SS2致病性機制的初步研究
　　 為了探討雙組分調(diào)控系統(tǒng)1910HK/RR調(diào)控SS2致病性的可能分子機制,首先,通過基因表達譜芯片片,開展了△1910hk/rr與WT差異表達基因分析。結(jié)果顯示:在整個基因組2194個基因中,△1910hk/rr有219個基因轉(zhuǎn)錄

11、水平發(fā)生了變化,占整個SS2基因組9.98％。其中105個基因下調(diào)表達1.5倍以上,114個基因上調(diào)1.5倍以上。有50個基因表達下調(diào)2倍以上,32個基因表達上調(diào)2倍以上。選取與氨基酸轉(zhuǎn)運、代謝、毒力、莢膜合成等相關(guān)的24下調(diào)表達的基因進行熒光定量PCR驗證,其結(jié)果也全部下調(diào),證實了芯片結(jié)果的可信性。為了研究1910HK/RR與唾液酸合成相關(guān)的4個基因(NeuB、NeuC、NeuD、NeuA)的結(jié)合特性,克隆、表達并純化雙組分調(diào)控系統(tǒng)1