SezAT系統(tǒng)及PlcR轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在2型豬鏈球菌中的作用研究.pdf

1、2型豬鏈球菌(Streptococcus suis serotype2,SS2)作為一種重要的人畜共患病原菌,不僅可引起世界范圍內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失,還威脅著公共衛(wèi)生安全。它在人間呈散發(fā)感染,所引起的病理表現(xiàn)通常只限于腦、心、肺及關(guān)節(jié),且預(yù)后良好。然而,我國1998年江蘇、2005年四川暴發(fā)的兩起大規(guī)模SS2感染人的疫情卻與既往報(bào)道的感染特點(diǎn)有顯著不同:第一,首次出現(xiàn)大規(guī)模人群感染病例;第二,有很高比例的感染者呈現(xiàn)出典型的鏈球菌中毒性休克

2、綜合征(Streptococcal toxic shock syndrome,STSS)的臨床癥狀,即使對這些患者使用大劑量抗生素干預(yù),也無法扭轉(zhuǎn)病程,許多患者都因?yàn)楦腥維S2后引起機(jī)體內(nèi)細(xì)胞因子的瀑布式爆發(fā)而死亡。以上情況強(qiáng)烈提示,我國疫區(qū)出現(xiàn)了高致病性SS2變異株。
　　為了對我國SS2流行菌株的高致病性進(jìn)行深入研究,課題組前期利用基因芯片結(jié)合比較基因組學(xué)技術(shù),將不同毒力、不同來源的18株SS2菌株基因組進(jìn)行系統(tǒng)分析,從全基因

3、組水平研究SS2在毒力和環(huán)境適應(yīng)力方面的進(jìn)化,發(fā)現(xiàn)我國SS2流行菌株所特有的89K毒力島(89K PAI),在其他一些SS2菌株基因組中部分存在且呈現(xiàn)出豐富的多態(tài)性,還鑒定出了一些毒力因子為強(qiáng)毒株所特有。因此,在我國疫情株中特有的89K毒力島和未被研究的毒力相關(guān)因子候選基因?qū)?型豬鏈球菌致病性的貢獻(xiàn)引起了我們的濃厚興趣。本文從以下2個(gè)方面對2型豬鏈球菌進(jìn)行研究:
　　1.毒素-抗毒素(TA)系統(tǒng)SezAT在穩(wěn)定89K致病島中的作用

4、。課題組前期的研究工作發(fā)現(xiàn)了我國高致病性SS2基因組特有的89K毒力島,該毒力島可以從宿主菌染色體上自發(fā)地切離并形成環(huán)形質(zhì)粒樣分子。為深入研究89K毒力島的功能,課題組試圖通過消除質(zhì)粒的方法消除89K,始終未果。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)89K上存在一個(gè)毒素-抗毒素(TA)系統(tǒng)SezAT,而TA系統(tǒng)是近年證實(shí)的一類能穩(wěn)定質(zhì)粒和基因組島等遺傳元件的功能系統(tǒng)。為揭示SezAT對89K毒力島的穩(wěn)定作用,本研究首先通過同源重組破壞SezAT系統(tǒng),然后通過C

5、re/loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)介導(dǎo)89K毒力島的消除,篩選89K缺失株,并采用相同的重組工具嘗試對沒有破壞SezAT系統(tǒng)的89K毒力島進(jìn)行消除實(shí)驗(yàn),以此作為對照,從而證實(shí)SezAT毒素-抗毒素系統(tǒng)的確為89K毒力島上極其重要的穩(wěn)定元件。利用基本生物學(xué)實(shí)驗(yàn)評價(jià)89K消除對SS2表型的影響。
　　2.轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PlcR在致病性中的作用。課題組前期的研究工作鑒定出了一些毒力因子為強(qiáng)毒株所特有,在所鑒定的毒力因子中,轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Plc

6、R由于在調(diào)節(jié)芽胞桿菌屬細(xì)菌的毒力方面起十分重要的作用,且目前它在鏈球菌屬中的功能研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo),這使得我們對它產(chǎn)生了興趣。為了探究PlcR在SS2致病過程中的作用,本研究利用生物信息學(xué)分析手段對其功能進(jìn)行預(yù)測,此后再通過同源重組的方法敲除plcR基因,研究PlcR在SS2致病過程中的作用。
　　本文的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與結(jié)果主要包括以下幾個(gè)方面:
　　1.SezAT系統(tǒng)基因敲除株的構(gòu)建:依據(jù)同源重組原理設(shè)計(jì)sezT基因敲除載體,該

7、載體上的篩選用標(biāo)記壯觀霉素抗性基因盒Spcr兩側(cè)添加了Cre重組酶識別位點(diǎn)loxP,將該敲除載體電轉(zhuǎn)05ZYH33電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞,通過篩選具壯觀霉素抗性表型的菌株,結(jié)合多重交叉PCR以及測序鑒定的方法,獲得sezT基因缺失突變株。再以此菌株制備電轉(zhuǎn)感受態(tài),轉(zhuǎn)入表達(dá)Cre重組酶的質(zhì)粒pCrePA2,30℃培養(yǎng)條件刪除抗性基因Spcr后,37℃培養(yǎng)條件消除質(zhì)粒pCrePA2。通過多重PCR和測序的方法篩選鑒定得到不含抗性篩選標(biāo)記的sezTl

8、oxP+/Spc-菌株,證實(shí)Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)在SS2中可以工作。
　　2.破壞SezAT系統(tǒng)的89K毒力島的消除實(shí)驗(yàn):依據(jù)同源重組原理,設(shè)計(jì)attL右側(cè)loxP位點(diǎn)敲入質(zhì)粒和attR左側(cè)loxP位點(diǎn)敲入質(zhì)粒。首先將attL右側(cè)loxP位點(diǎn)敲入質(zhì)粒電轉(zhuǎn)sezTloxP+/Spc-電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞,通過篩選具氯霉素抗性表型的菌株,結(jié)合多重交叉PCR以及測序鑒定的方法,獲得attL右側(cè)引入loxP位點(diǎn)的sezTloxP+

9、/Spc-。再以此菌株制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)入表達(dá)Cre重組酶的質(zhì)粒pCrePA2,30℃培養(yǎng)條件消除89K毒力島左半部后,37℃培養(yǎng)條件消除質(zhì)粒pCrePA2。通過平行接種培養(yǎng)、多重PCR和測序的方法篩選鑒定得到89K毒力島左半部缺失突變株。之后再將attR左側(cè)loxP位點(diǎn)敲入質(zhì)粒電轉(zhuǎn)89K毒力島左半部缺失突變株電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞,通過篩選具壯觀霉素抗性表型的菌株,結(jié)合多重交叉PCR以及測序鑒定的方法,獲得attR左側(cè)引入loxP位點(diǎn)的8

10、9K毒力島左半部缺失突變株,再以此菌株制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)入表達(dá)Cre重組酶的質(zhì)粒pCrePA2,30℃培養(yǎng)條件消除89K毒力島右半部后,37℃培養(yǎng)條件消除質(zhì)粒pCrePA2。通過平行接種培養(yǎng)、多重PCR和測序的方法篩選鑒定得到89K毒力島缺失突變株89K。
　　3.未破壞SezAT系統(tǒng)的89K毒力島的消除嘗試:將attL右側(cè)loxP位點(diǎn)敲入質(zhì)粒電轉(zhuǎn)05ZYH33電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞,通過篩選具氯霉素抗性表型的菌株,結(jié)合多重交叉PCR

11、以及測序鑒定的方法,獲得attL右側(cè)引入loxP位點(diǎn)的05ZYH33菌株。再以此菌株制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)入attR左側(cè)loxP位點(diǎn)敲入質(zhì)粒,通過篩選具壯觀霉素抗性表型的菌株,結(jié)合多重交叉PCR以及測序鑒定的方法,獲得attL右側(cè)引入loxP位點(diǎn)且attR左側(cè)引入loxP位點(diǎn)的05ZYH33菌株,再以此菌株制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)入表達(dá)Cre重組酶的質(zhì)粒pCrePA2,30℃培養(yǎng)條件消除89K毒力島右半部后,37℃培養(yǎng)條件消除質(zhì)粒pCre

12、PA2。通過平行接種培養(yǎng)、PCR的方法篩選89K毒力島缺失突變株89K,沒有獲得89K缺失突變株。此項(xiàng)對照實(shí)驗(yàn)凸顯了SezAT系統(tǒng)對89K毒力島具有極其重要的穩(wěn)定作用。
　　4.89K菌株的基本生物學(xué)性狀分析:相同培養(yǎng)條件下比較野生株05ZYH33與突變株?89K在生長曲線、溶血活性以及莢膜形態(tài)上的差異。結(jié)果顯示,缺失89K毒力島對SS2的這3個(gè)基本生物學(xué)性狀沒有顯著影響。
　　5.PlcR的生物信息學(xué)分析:運(yùn)用NCBI數(shù)據(jù)

13、庫的BLAST比對工具對05SSU0241和05SSU0242基因的編碼產(chǎn)物進(jìn)行比對分析,發(fā)現(xiàn)二者與蠟樣芽胞桿菌的PlcR蛋白的相似性分別為46％與28%,再利用Pfam軟件和InterPro軟件對這2個(gè)基因的編碼產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測,分析結(jié)果顯示05SSU0241基因編碼產(chǎn)物含有一個(gè)λ抑制子樣的HTH結(jié)構(gòu)域((Lambda repressor-like helix-turn-helix domain),這一結(jié)構(gòu)域?yàn)樘禺惖腄NA結(jié)合區(qū)域,

14、許多具有此結(jié)構(gòu)域的蛋白都發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的作用。05SSU0242基因編碼產(chǎn)物含有一個(gè)肽重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(Tetratricopeptide repeat,TPR),這種結(jié)構(gòu)域可介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用,并在一些重要的蛋白復(fù)合物的形成中扮演重要角色。這些生物信息學(xué)分析結(jié)果都提示,05SSU0241與05SSU0242可能就是鏈球菌屬中的plcR基因,對相關(guān)基因行使轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能,但尚需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　6.plcR基因缺失突變株的構(gòu)建:依據(jù)同源

15、重組原理設(shè)計(jì)plcR基因敲除載體,以05ZYH33基因組DNA為模板,分別擴(kuò)增plcR基因上下游片段作為plcR基因敲除載體的同源左右臂,再以pSET4S質(zhì)粒DNA為模板,擴(kuò)增得到抗性基因盒Spcr,將所得片段純化后依次連接到pUC18載體中,成功構(gòu)建plcR基因敲除載體。將該載體電轉(zhuǎn)05ZYH33電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞,篩選壯觀霉素抗性表型的菌株,結(jié)合多重交叉PCR和測序的方法鑒定獲得plcR基因缺失突變株plcR。
　　7.plcR基

16、因與SS2毒力關(guān)系的初探:采用相同菌量(107CFU/ml)的野生株05ZYH33和突變株plcR攻擊BALB/c雌性4周齡小鼠,將兩組小鼠分別命名為野生組與敲除組,結(jié)果顯示,這2組小鼠均出現(xiàn)典型的SS2感染癥狀,但是敲除組在感染12h后不再有小鼠死亡,且存活小鼠預(yù)后良好,死亡率為30%,而野生組小鼠感染癥狀較敲除組嚴(yán)重,死亡率為60%,小鼠攻毒實(shí)驗(yàn)顯示,plcR基因缺失突變株的毒力較野生株顯著降低,這提示我們plcR基因與SS2的致病

17、性相關(guān)。
　　綜上所述,本文通過比較SezAT毒素-抗毒素系統(tǒng)破壞前后,利用Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)消除89K毒力島的效率,證實(shí)SezAT系統(tǒng)作為極其重要的穩(wěn)定元件在89K毒力島穩(wěn)定存在于基因組中發(fā)揮關(guān)鍵作用。再通過89K毒力島缺失前后的基本生物學(xué)性狀的差異比較,發(fā)現(xiàn)89K毒力島對實(shí)驗(yàn)中考察的3個(gè)基本生物學(xué)性狀沒有顯著影響,獲得了一株89K毒力島缺失突變株,為后續(xù)研究89K PAI對SS2致病性的貢獻(xiàn)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。另一